不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法技术

本发明专利技术属于基因转录调控领域，具体涉及一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法。该方法包括以下步骤：S1、构建带有rFC标签的目的转录因子表达质粒，进而向细胞中引入TF‑rFC融合蛋白表达，培养到所需时期后收集细胞，并用磁珠偶联细胞；S2、通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)‑MNase融合蛋白孵育过夜；S3、通过加入CaCl

【技术实现步骤摘要】
不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法
本专利技术属于基因转录调控领域，具体涉及一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法。技术背景转录因子(TranscriptionFactors,TFs)能够以序列特异性方式结合DNA来控制染色质结构和基因转录，对发育、分化、肿瘤发生等生命过程和疾病过程中的细胞命运决定具有至关重要的作用。尽管众多科学家对理解TF如何控制基因表达有着浓厚兴趣，精准定位TF在全基因组上的结合位点仍然具有挑战性。因此全基因组TF结合数据对于了解它们如何参与基因转录调控至关重要。染色质免疫沉淀测序(ChromatinImmunoprecipitationSequencing，ChIP-seq)被广泛用于分析TF的全基因组结合位点，通常情况下单个TF的ChIP-seq实验需要106甚至更多的细胞，这样的细胞量对于在早期胚胎发育等稀有样品中研究TF的作用几乎是不可能实现的。另一方面TF的ChIP-seq实验需要高质量的特异性抗体，但是目前人和小鼠中的大部分TF都缺乏高质量的特异性抗体，而对于斑马鱼、爪蟾等非哺乳动物物种中，几乎所有的TF都缺乏高质量的特异性抗体。为了避免抗体的限制，可以通过在所研究的TF中添加标签并使用标签抗体来产生TF的全基因组结合数据；然而对于大量细胞的需求仍然是研究TF在早期胚胎发育等稀有样品中参与细胞命运决定的功能和机制的一个障碍。因此，为了揭示关键TF在重要生命活动过程中的作用机制，需要一种新的技术来检测TF在全基因组上的结合位点。最近，CUT&RUN(CleavageUnderTargetsandReleaseUsingNuclease)被认为是一种可用于检测TF在全基因组结合位点的替代技术。与ChIP-seq相比，CUT&RUN所需的细胞要少，这使得其在早期胚胎发育等稀有样品中分析TF的结合位点成为可能。然而CUT&RUN仍然依赖于高质量的特异性抗体，这限制了它应用与于抗体效率低的TF或非哺乳动物模式生物中。
技术实现思路
在本专利技术方法中，我们提出了一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法(FcfragmentofimmunoglobulinGtaggingfollowedbyCUT&RUN(FitCUT&RUN))。FitCUT&RUN通过pA(G)-MNase中的proteinA(G)与rFc区(兔IgG的Fc肽段)的直接相互作用，将MNase核酸酶带入目标染色质区域剪切、释放目标TF在基因组结合位点片段，这使得在早期胚胎发育等稀有样品中检测TF在全基因组上的结合位点及研究TF的作用机制成为可能。本专利技术的一个目的是提供一种可应用于细胞系中不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种可应用于早期胚胎发育等稀有样品中不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法，从而研究关键TF对早期胚胎发育等重要生命活动过程中的调控机制。具体的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术第一个方面公开了一种不依赖于特异性抗体的捕获转录因子在全基因组上结合位点的方法，该方法包括以下步骤：S1、构建带有rFC标签的目的转录因子表达质粒，进而向细胞中引入TF-rFC融合蛋白表达，培养到所需时期后收集细胞，并用ConcanavalinA磁珠偶联细胞；S2、利用digitonin通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)-MNase融合蛋白，4-5摄氏度条件下轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，proteinA(G)识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域；S3、通过加入CaCl2，活化MNase，使MNase在目的TF结合位点周围进行DNA双链切割，加入EDTA螯合钙离子终止反应并收集释放出核的TF-染色质复合物，去除RNA和蛋白质后，酚/氯仿/异戊醇抽提纯化DNA片段；S4、将上述纯化后的DNA片段进行测序文库构建并进行高通量测序。优选的，所述细胞为K562细胞系。应当理解，本专利技术中的细胞不局限于K562细胞系，本领域技术人员可以根据需要，选择任意合适的细胞来完成本专利技术的技术方案，且均在本专利技术的保护范围之内。更优选的，步骤S1包括：S11、构建带有rFc标签的转录因子载体，电转进K562细胞系中，培养18-24h后，收集细胞，用洗涤缓冲液洗涤后重悬得到细胞悬液；S12、将平衡好的ConcanavalinA磁珠加入到细胞悬液中，孵育20-30min，得到磁珠偶联细胞。更优选的，步骤S2包括：用抗体缓冲液重悬磁珠偶联细胞，冰上放置30分钟，用dig-washingbuffer洗涤后，重悬，加入pA(G)-MNase融合蛋白，在4摄氏度条件下，轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，pA(G)去识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域。更优选的，步骤S3包括：S31、dig-washingbuffer洗涤后重悬磁珠偶联细胞，0摄氏度下预冷5分钟，加入CaCl2，轻轻涡旋后立即返回0摄氏度，反应20-35分钟；S32、加入终止缓冲液，轻轻涡旋后，37摄氏度孵育30-40分钟，终止反应并将切开的TF-染色质复合物释放出核，离心后，将上清转移至新的离心管中，加SDS、蛋白酶K，混匀后，55摄氏度孵育30-40分钟，去除蛋白质；S33、将样品加酚/氯仿/异戊醇充分混匀，常温离心后，转移至新的容器中，加入糖原，NaAc和异丙醇，混匀后，-20摄氏度沉淀30分钟，离心后用80％乙醇洗涤后，干燥，用EB溶解。更优选的，所述细胞为斑马鱼胚胎细胞。应当理解，本专利技术中的细胞不局限于斑马鱼胚胎细胞，本领域技术人员可以根据需要，选择任意合适的物种来完成本专利技术的技术方案，且均在本专利技术的保护范围之内。更优选的，在S1中，将构建带有rFc标签的Nanog载体，通过体外转录试剂盒获得Nanog-rFc的mRNA，在斑马鱼胚胎一细胞时期将Nanog-rFcmRNA显微注射至胚胎中，培养至所需时期后收集细胞。优选的，在S4中，利用KAPA建库试剂盒进行文库扩增并通过Xten平台进行高通量测序。本专利技术第二个方面公开了根据上述的方法在基因转录调控领域中的应用。与现有技术相比，本专利技术至少具有以下区别技术特征：相比于现有的ChIP-seq技术，本专利技术创建了一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法，名为FitCUT&RUN。本专利技术方法一方面规避了传统用于富集TF在基因组上结合位点的方法中高质量特异性抗体的需要，尤其适用于抗体效率低的TF或在无有效抗体的非哺乳动物模式生物中，例如斑马鱼、爪蟾等；另一方面由于省略了抗体孵育步骤，避免由于抗体效率影响特异性结合位点的富集，进而可以使用少至5000个细胞在全基因组水平上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不依赖于特异性抗体的捕获转录因子在全基因组上结合位点的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/nS1、构建带有rFC标签的目的转录因子表达质粒，进而向细胞中引入TF-rFC融合蛋白表达，培养到所需时期后收集细胞，并用Concanavalin A磁珠偶联细胞；/nS2、利用digitonin通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)-MNase融合蛋白，4-5摄氏度条件下轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，protein A(G)识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域；/nS3、通过加入CaCl

【技术特征摘要】
1.一种不依赖于特异性抗体的捕获转录因子在全基因组上结合位点的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、构建带有rFC标签的目的转录因子表达质粒，进而向细胞中引入TF-rFC融合蛋白表达，培养到所需时期后收集细胞，并用ConcanavalinA磁珠偶联细胞；
S2、利用digitonin通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)-MNase融合蛋白，4-5摄氏度条件下轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，proteinA(G)识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域；
S3、通过加入CaCl2，活化MNase，使MNase在目的TF结合位点周围进行DNA双链切割，加入EDTA螯合钙离子终止反应并收集释放出核的TF-染色质复合物，去除RNA和蛋白质后，酚/氯仿/异戊醇抽提纯化DNA片段；
S4、将上述纯化后的DNA片段进行测序文库构建并进行高通量测序。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为K562细胞系。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1包括：
S11、构建带有rFc标签的转录因子载体，电转进K562细胞系中，培养18-24h后，收集细胞，用洗涤缓冲液洗涤后重悬得到细胞悬液；
S12、将平衡好的ConcanavalinA磁珠加入到细胞悬液中，孵育20-30min，得到磁珠偶联细胞。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2包括：
用抗体缓冲液重悬磁珠偶联细胞，冰上放置30分钟，用dig-washingbuffer洗涤后，重...

【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，刘桂芬，王湘秀，王文，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31