一种具有双表达盒的GS表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种高表达细胞株开发中谷氨酰胺合成酶表达载体的构建及应用。本发明专利技术所提供的谷氨酰胺合成酶表达载体具有第一表达盒元件，第二表达盒元件，谷氨酰胺合成酶表达元件，氨苄青霉素β内酰胺酶水解酶表达元件，复制起始位点ORI，该载体被命名为PGS‑2，利用该构建的谷氨酰胺合成酶表达载体可同时表达两个蛋白，或者表达一个蛋白的两个亚基，最后进行组装，与现有方法相比具有更好的操作便利性，且蛋白表达量提高了8倍以上。

【技术实现步骤摘要】
一种具有双表达盒的GS表达载体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高表达细胞株开发中谷氨酰胺合成酶表达载体的构建及应用。
技术介绍
纵观2018年，全球畅销药物排行榜，最畅销的10大药物中，生物技术蛋白类药物，占了9席，抗体药王修美乐(Humira)自2012年来一直居首位，2018年销售199.36亿美金。蛋白类药物已经成为药物市场的主力军，在肿瘤类疾病，血管类疾病，风湿类疾病，高血压等疾病中，均有亮眼的表现。生物技术的发展也是日新月异，蛋白类药物从细胞因子、Fc融合蛋白、单克隆抗体、纳米抗体到双特异性抗体，逐步进化，并且随着现代培养基技术、细胞株和载体的改造技术的进步，细胞的表达量在逐渐的上升，抗体表达量也从mg/L到g/L。在哺乳动物细胞大规模生产中，常用的可扩增选择标志基因最常用的基因筛选扩增系统有二氢叶酸还原酶系统(DHFR)和谷氨酰胺合成酶系统(GS)。二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤(MTX)所抑制，含有的目的基因及与之相连的DHFR筛选标记基因在MTX的浓度不断提高的条件下，两个基因偶联，进行扩增数千倍，从而提高目的基因的表达量。谷氨酰胺合成酶系统(GS)是最近新发展的基因筛选扩增系统，较DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛地认可，系统中加入谷氨酰胺合成酶的抑制剂蛋氨酸磺酰胺(MSX)，可使GS基因及与之相连的目的基因扩增，达到提高目的基因表达水平的目的。GS系统相比于DHFR系统有更好的应用便利性，GS系统只需要一轮加压，就可完成表达细胞株的筛选，不需要多轮加压，提高蛋白的表达量，而DHFR系统需要多轮的逐渐加压，时间周期长，操作繁琐。并且GS系统在大规模发酵培养时无需添加谷氨酰胺，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺，避免谷氨酰胺分解造成体系中氨浓度过高，造成对细胞的损伤，降低了成本，降低了工艺控制难度，细胞在大规模开发中有更好的表现。目前，市场上表现较好的细胞株有Lonza公司的CHOK1SVGS-KO细胞株、Merk公司(原SAFC)的CHOZNCHOK1细胞株和HorizonDiscovery公司的CHOGSnull细胞株。Lonza和Merk公司是用ZFN技术进行GS基因敲除，HorizonDiscovery公司是用rAAV病毒技术进行GS基因敲除。国内有多家公司分别引进了不同的细胞表达系统，进行蛋白的表达，但是这些系统的使用费一般在几百万到上千万，甚至还有上市后药物的销售分成，严重限制这些系统的使用。现急需开发一款适合我们自己的表达量较高的细胞表达系统。Lonza公司的PXC17.4载体和PXC18.4载体，为两个载体的组合，表达一个蛋白时用PXC17.4载体，表达两个蛋白时，两个蛋白分别克隆入PXC17.4载体和PXC18.4载体，并且通过酶切，连接，构建一个含有两个表达盒的表达体系，操作繁琐。专利CN104195173公布了一个具有双表达盒的谷氨酰胺表达载体，也含有两个表达盒，但是其在实施例中的表达量仅有600mg/L，表达量偏低，严重限制其应用。我们针对目前对表达体系的需求，开发了一款表达量较高的GS双表达盒表达载体，表达量较高，已经在多种蛋白上成功使用。
技术实现思路
本专利技术公布了一种具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶表达载体，以及该载体在制备抗体中的应用，从而解决现有技术中的产物的产率低、操作繁琐、价格高等问题。本专利技术的第一个目的在于提供一种谷氨酰胺合成酶表达载体，其具有两个蛋白表达盒，可同时表达两个蛋白，或者表达一个蛋白的两个亚基，最后进行组装，该载体被命名为PGS-2。所述谷氨酰胺合成酶表达载体包括第一表达盒元件，第二表达盒元件，谷氨酰胺合成酶表达元件，氨苄青霉素β内酰胺酶水解酶表达元件，复制起始位点ORI。所述谷氨酰胺合成酶表达载体基因序列如SEQIDNO：1所示；第一表达盒元件基因序列如SEQIDNO：2所示；所述第二表达盒元件基因序列如SEQIDNO：3所示；所述谷氨酰胺合成酶表达元件基因序列如SEQIDNO：4所示；所述氨苄青霉素β内酰胺酶水解酶表达元件基因序列如SEQIDNO：5所示；复制起始位点ORI基因序列如SEQIDNO：6所示。优选地，所述谷氨酰胺合成酶表达载体还包括启动子、终止子、酶切位点。优选地，所述启动子选自hCMV、hEF-1α、SV40中的一种或多种。优选地，所述终止子选自SV40-PolyA、TK-PolyA、SV40中的一种或多种。优选地，所述酶切位点选自HindⅢ酶、EcoRⅠ酶、PacⅠ酶或NotⅠ酶中的一种或多种。更优选地，第一表达盒元件包含hCMV启动子和SV40-PolyA终止子，HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点。更优选地，第二表达盒元件包含hEF-1α启动子和TK-PolyA终止子，PacⅠ和NotⅠ酶切位点。更优选地，谷氨酰胺合成酶表达元件包含SV40启动子和SV40终止子。本专利技术的第二个目的在于提供谷氨酰胺合成酶表达载体在蛋白表达中的应用。本专利技术的谷氨酰胺合成酶表达载体可用于细胞因子、融合蛋白、抗体、双特异性抗体、膜蛋白等的表达。在一个优选实施例中，将编码氨基酸序列如SEQIDNO：9所示FGF21-Fc的多核苷酸克隆入表达载体PGS-2中，构建PGS-2-FGF21-Fc表达载体，而后将该重组表达载体转染CHO-K1细胞表达目的蛋白；根据现有技术公开的方法构建p327.7-FGF21-Fc表达载体，而后将该重组表达载体转染CHO-K1细胞表达目的蛋白。结果表明，本专利技术的载体PGS-2可使得FGF21-Fc融合蛋白的表达量大幅度提高，与载体p327.7相比，提高了8.23倍。在一个更优的实施例中，首先，将核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的PUC57-FGF21-Fc用HindⅢ和EcoRI酶进行双酶切，回收目的片段，将目的片段与同样经限制性内切酶HindⅢ和EcoRI双酶切的载体PGS-2连接，构建重组真核表达载体PGS-2-FGF21-Fc，转化大肠杆菌E.coliDH5a，过夜培养后挑取阳性克隆进行小量质粒提取，限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定，将鉴定阳性的克隆送上海生物工程有限公司测序，选择测序正确的克隆进行大量质粒提取。然后用限制性内切酶NruI线性化，乙醇沉淀法回收质粒，-20℃保存备用。其次，上述重组表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1细胞)并表达目的蛋白：采用脂质体法(FreestyleMAX，invitrogen)，将线性化后质粒PGS-2-FGF21-Fc转染CHO-K1细胞，检测FGF21-Fc融合蛋白表达情况。质粒转染按照FreestyleTMMAX转染试剂使用说明书，CHO-K1细胞转染前一天按照0.5×106/ml传代，转染当天计数，调整细胞密度为1×106/ml，37℃培养。然后配制转染溶液，将37.5μg线性化质粒PGS-2-FGF21-Fc分别加入OptiPROTMSFM培养基至1.5ml，37.5ul本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种谷氨酰胺合成酶表达载体，其特征在于，该载体含有第一表达盒元件，第二表达盒元件，谷氨酰胺合成酶表达元件，氨苄青霉素β内酰胺酶水解酶表达元件，复制起始位点ORI，其序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
20191219 CN 20191131789271.一种谷氨酰胺合成酶表达载体，其特征在于，该载体含有第一表达盒元件，第二表达盒元件，谷氨酰胺合成酶表达元件，氨苄青霉素β内酰胺酶水解酶表达元件，复制起始位点ORI，其序列如SEQIDNO：1所示。


2.根据权利要求1所述的谷氨酰胺合成酶表达载体，所述的第一表达盒元件包含hCMV启动子和SV40-PolyA终止子，HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，其序列如SEQIDNO：2所示。


3.根据权利要求1所述的谷氨酰胺合成酶表达载体，所述的第二表达盒元件包含hEF-1α启动子和TK-PolyA终止...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵丽丽，朱中松，刘忠，
申请(专利权)人：鲁南制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37