【技术实现步骤摘要】
蜱传脑炎病毒报告病毒TBEVNluc2A的构建方法及其应用
本专利技术涉及蜱传脑炎病毒(TBEV)报告病毒的构建，特别涉及稳定表达含有Nluc荧光素酶的报告病毒的构建及其活性检测。
技术介绍
在中国，第一例人类蜱传脑炎(TBE)病例于1943年被发现。TBE在中国的分布与其蜱媒的分布密切相关。我国TBE病例均为远东亚型，由全沟硬蜱传播。内蒙古大兴安岭、黑海龙江小兴安岭、吉林省长白山林区是东北地区典型的TBE疫区。西北地区的新疆天山北坡林区和阿尔泰南坡林区也有间歇性的TBE报告。此外，TBE在云南(中国西南部)和西藏(中国西部)也有报道。由于TBE在中国不是强制报告的传染病，缺乏对该病的监测，其发病率很可能被低估。并且该病有区域性、季节性、职业性等特征，因此增强我国对该病的检测和对TBEV的相关研究以达到对该病的控制是必要且可行的。蜱传脑炎病毒(TBEV)是黄病毒蜱传类群中最重要的一种。TBEV有一个约11千碱基长的正链RNA基因组，基因组包括5'UTR和3'UTR以及一个开放阅读框(Openreadingframe，ORF)，基因组总共编码3414个氨基酸，并翻译成单个多蛋白，该多蛋白经共转录和转录后加工成三种结构蛋白(Structuralprotein，SP)和七种非结构蛋白(Non-structuralprotein，nSP)[21]。其中，结构蛋白有C、PrM和E蛋白，非结构蛋白有NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。相比于其他黄病毒尤其是蚊媒病毒，蜱传病毒研究相对较少，很多功
【技术保护点】
1.蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)SnaBI-C38片段的克隆：以TBEV FL为模板，引物1和引物2为特异性引物，PCR扩增蜱传脑炎病毒SnaBI-C38片段；所述引物1和引物2的序列为：/n引物1：/n5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；/n引物2：/n5’-GTGTGAAGACCATCACGAGTCCATTTGGC-3’；/n2)P2A序列和Nluc基因的连接：将P2A序列设计在引物上，并分两轮PCR将P2A序列连接到Nluc基因上；第一轮PCR：Nluc-pGEMT为模板，Nluc-F和P2A Nluc R1为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带；进行第二轮PCR：第一轮PCR回收的目的条带为模板，Nluc-F和P2A Nluc R2为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带；将第二轮PCR回收的目的条带连接到pGEM T载体上，命名为Nluc 2A pGEM T；所述引物Nluc-F、引物P2A Nluc R1和引物P2A Nluc R2的序列为：/n引物Nluc-F：/n5’...
【技术特征摘要】
1.蜱传脑炎病毒报告病毒TBEVNluc2A的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)SnaBI-C38片段的克隆：以TBEVFL为模板，引物1和引物2为特异性引物，PCR扩增蜱传脑炎病毒SnaBI-C38片段；所述引物1和引物2的序列为：
引物1：
5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；
引物2：
5’-GTGTGAAGACCATCACGAGTCCATTTGGC-3’；
2)P2A序列和Nluc基因的连接：将P2A序列设计在引物上，并分两轮PCR将P2A序列连接到Nluc基因上；第一轮PCR：Nluc-pGEMT为模板，Nluc-F和P2ANlucR1为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带；进行第二轮PCR：第一轮PCR回收的目的条带为模板，Nluc-F和P2ANlucR2为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带；将第二轮PCR回收的目的条带连接到pGEMT载体上，命名为Nluc2ApGEMT；所述引物Nluc-F、引物P2ANlucR1和引物P2ANlucR2的序列为：
引物Nluc-F：
5’-ATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；
引物P2ANlucR1：
5’-CAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCCGCCAGAATGCGTTCGCAC-3’；
引物P2ANlucR2：
5’-AGGTCCAGGGTTCTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAG-3’；
3)Nluc-P2A片段的克隆：以Nluc2ApGEMT为模板，引物3和引物4为特异性引物，扩增出Nluc-P2A片段；所述引物3和引物4的序列为：
引物3：
5’-CAAATGGACTCGTGATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；
引物4：
5’-CTTCCCGGCCATAGGTCCAGGGTTCTCCTC-3’；
4)C1-AflⅡ片段的克隆：以TBEVFL为模板，引物5和引物6为特异性引物，扩增出C1-AflⅡ片段；所述引物5和引物6的序列为：
引物5：
5’-GAACCCTGGACCTATGGCCGGGAAGGCCATTC-3’；
引物6：
5’-CTTAAGCAACACTCCAGTCTGG-3’；
5)构建SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段：以引物1和引物6为特异性引物，以步骤1)获得的SnaBI-C38片段、步骤3)获得的Nluc-P2A片段和步骤4)获得的C1-AflⅡ片段为模板，通过重叠延伸PCR，将三个片段连接在一起，得到SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段；
6)将SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段和TBEV的感染性克隆用SnaBI和AflⅡ双酶切，将酶切片段跑胶回收，再用T4连接酶进行连接，获得蜱传脑炎病毒报告病毒TBEVNluc2A。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述蜱传脑炎病毒报告病毒TBEVNluc2A的DNA序列如SEQIDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱春玉，王旌羽，李辉，张学敏，高薇，胡媛媛，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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