一种流感病毒NS1蛋白的表达质粒、重组蛋白和特异性单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种流感病毒NS1蛋白的表达质粒、重组蛋白和特异性单克隆抗体及应用，涉及抗体工程技术领域。本发明专利技术通过体外重组表达A型流感病毒的NS1蛋白，筛选出了对流感病毒感染的小鼠具有治疗效果的单克隆抗体。在本发明专利技术实施例中，所述单克隆抗体，对A型流感病毒感染的小鼠具有治疗效果，为预防和治疗流感病毒提供了一种策略，具有广阔的临床应用前景。具有广阔的临床应用前景。具有广阔的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种流感病毒NS1蛋白的表达质粒、重组蛋白和特异性单克隆抗体及应用
[0001]

[0002]本专利技术属于抗体工程
，具体涉及一种流感病毒NS1蛋白的表达质粒、重组蛋白和特异性单克隆抗体及应用。

技术介绍

[0003]流感病毒是一种能够造成人类和动物患流行性感冒的RNA病毒，属正黏病毒科，为分节段的单负链RNA病毒。流感病毒易发生抗原变异，抗原漂移与抗原转变是主要的抗原变异形式。按核蛋白核基质蛋白抗原性的不同，流感病毒分为A、B、C、D四型，A型流感病毒最易发生变异，已引起多次大流行。B型流感病毒对人类致病性也比较强，但是人们还没有发现B型流感病毒引起过世界性大流行；C型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。流感病毒在健康人群的感染多为自限性，尚无特效药物。接种疫苗是预防流感病毒的最有效的方法，但由于流感病毒容易发生抗原漂移和抗原转换，导致每年流行株的变化、疫苗免疫力的差异，在大流行流感发生时，生产用毒株选择的滞后导致疫苗不能够快速上市，难以在病毒流行初期为人群提供有效的免疫保护。因此，开发针对流感病毒有效的预防和治疗药物依然任重道远。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种流感病毒NS1蛋白的表达质粒、重组蛋白和特异性单克隆抗体及应用，所述单克隆抗体对A型流感病毒具有治疗效果，为流感病毒的治疗提供一种参考。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种包含A型流感病毒NS1保守片段的重组质粒，所述NS1保守片段的编码基因包括SEQ ID NO.1所示的序列。
[0006]优选的，所述重组质粒的基础载体包括pET28a。
[0007]优选的，所述NS1保守片段的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
[0008]本专利技术还提供了一种表达A型流感病毒NS1保守片段的重组菌，所述重组菌的基因组包含上述重组质粒。
[0009]本专利技术还提供了一种与重组NS1蛋白发生特异性反应的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括5F11和3E5，所述5F11的重链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3~SEQ ID NO.5所示；所述5F11的轻链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8~SEQ ID NO.10所示；所述3E5的重链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.15所示；所述3E5的轻链可变区包括三个互补决定区，所述互
补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18~SEQ ID NO.20所示；所述重组NS1蛋白由上述重组菌经IPTG诱导得到。
[0010]优选的，所述5F11的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述5F11的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
[0011]优选的，编码所述5F11的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码所述5F11的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0012]优选的，所述3E5的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述3E5的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。
[0013]优选的，编码所述3E5的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，编码所述3E5的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
[0014]本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备预防和/或治疗A型流感病毒感染引发疾病的疫苗或药物中的应用。
[0015]有益效果：本专利技术通过体外重组表达A型流感病毒的NS1蛋白，筛选出了对流感病毒感染的小鼠具有治疗效果的单克隆抗体。在本专利技术实施例中，所述单克隆抗体，对A型流感病毒感染的小鼠具有治疗效果，这是除HA和NA保护性抗体之外的治疗流感病毒的又一方法。由于针对的是A型流感病毒NS1中的保守序列，既然该抗体能够治疗感染H1N1的小鼠，对其他的A型流感病毒也具有一定的理论保护作用，即为预防和治疗流感病毒提供了一种策略，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
[0016]图1为pET28a
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NS1蛋白的SDS
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PAGE鉴定图；图2为重组NS1蛋白与小鼠血清的反应性；图3为杂交瘤细胞上清检测结果；图4为单克隆抗体的SDS
‑
PAGE鉴定图；图5为纯化的单克隆抗体与NS1蛋白的结合力；图6为单克隆抗体交叉反应分析；图7为小鼠感染和给药后的体重变化。
具体实施方式
[0017]本专利技术提供了一种包含A型流感病毒NS1保守片段的重组质粒，所述NS1保守片段的编码基因包括SEQ ID NO.1所示的序列。
[0018]在本专利技术中，NS1蛋白（Nonstructral protein 1）是流感病毒第8条RNA编码的非结构蛋白，是一种RNA结合蛋白，具有重要的调节活性。NS1蛋白具有高度的保守性，仅存在于病毒感染的细胞内，并未被包装进病毒颗粒内；NS1蛋白在调节流感病毒的毒力和致病性方面发挥着重要作用，其可通过抑制宿主细胞蛋白的合成、诱导细胞凋亡及拮抗干扰素的产生等方面调节机体的抗病毒反应，从宿主和病毒两方面调节病毒的毒力，间接地发挥增强病毒致病性的作用。NS1蛋白虽然为流感病毒的非结构蛋白，却在病毒复制中具有不可替代的作用。在本专利技术中，所述NS1保守片段经过序列优化，形成SEQ ID NO.1所示的序列；且该片段的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。
[0019]本专利技术所述重组质粒的基础载体优选包括pET28a，将所述NS1保守片段的编码基因插入pET28a的BamHI和SalI酶切位点之间。
[0020]本专利技术还提供了一种表达A型流感病毒NS1保守片段的重组菌，所述重组菌的基因组包含上述重组质粒。
[0021]本专利技术优选将上述重组质粒pET28a
‑
NS1转化BL21（DE3）感受态细胞，转化菌涂布于LB琼脂平板（含50μg/mL卡那霉素），37℃过夜培养。本专利技术对所述转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规转化方法即可。
[0022]本专利技术还提供了一种利用上述重组菌诱导产生重组NS1蛋白的方法，优选包括以下步骤：挑取上述LB琼脂平板过夜培养的单菌落接入5 mL LB培养基（含50μg/mL卡那霉素）中，37℃，220转/分振荡培养过夜。按培养基总体积的1%的量接种到LB培养基（含50μg/mL卡那霉素）中，37℃，220转/分振荡培养3小时左右，至OD
600
为0.5，于16℃降温1.5小时，加终浓度为0.1 mM IPTG，16℃，220转/分诱导16小时后收集菌体，菌体破碎后纯化。在本专利技术中，因表达的重组蛋白均带有组氨酸标签，因此用GE公司的AKTA Start和HisTrapTM HP层析柱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含A型流感病毒NS1保守片段的重组质粒，所述NS1保守片段的编码基因包括SEQ ID NO.1所示的序列。2.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的基础载体包括pET28a。3.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述NS1保守片段的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。4.一种表达A型流感病毒NS1保守片段的重组菌，其特征在于，所述重组菌的基因组包含权利要求1~3任一项所述重组质粒。5.一种与重组NS1蛋白发生特异性反应的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括5F11和3E5，所述5F11的重链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3~SEQ ID NO.5所示；所述5F11的轻链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8~SEQ ID NO.10所示；所述3E5的重链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13~SEQ ID NO.15所示；所述3E5的轻链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢帅，张兴林，李月，陈曼丽，张东晖，宋文俊，
申请(专利权)人：北京溯本源和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：