一种抗非洲猪瘟克隆猪的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗非洲猪瘟克隆猪的制备方法，属于动物基因工程和基因遗传修饰领域。用CRISPR/Cas9基因敲入技术，将CRISPR/Cas9打靶载体，与猪Rosa26基因donor载体共转入猪成纤维细胞中，获得阳性细胞克隆，阳性克隆中猪Rosa26基因的第1内含子被敲入能表达特异性靶向敲除病毒pE248R基因的sgRNA‑Cas9的基因，使病毒在体内繁殖时被靶向敲除pE248R基因，使猪具有ASFV抗性；再通过体细胞核移植技术获得克隆胚胎；将克隆胚胎移入猪子宫内妊娠获得克隆猪。本发明专利技术首次将sgRNA‑Cas9系统敲入猪体内，并使其稳定表达而获得ASFV抗性，为抗非洲猪瘟育种研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种抗非洲猪瘟克隆猪的制备方法
本专利技术涉及动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种抗非洲猪瘟克隆猪的制备方法。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，通常表现出全身出血、神经症状和呼吸困难等临床症状，具有病程时间短、高病死率等特征。ASFV是一种单分子线状双链DNA病毒，属于双链DNA病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属，是ASFV家族中的唯一成员，也是唯一的虫媒DNA病毒。ASF的主要传染源是感染猪和带毒猪，受感染的组织、血液、猪的分泌物和排泄物中都含有病毒，病毒可附着在饲料、运输车等物体进行传播，除直接接触传播外，ASFV还能通过蜱虫进行传播。2018年8月，我国确诊了首例ASF疫情，随后ASFV在我国快速传播，目前全国已有31个省、自治区、直辖市和香港特别行政区暴发了ASF疫情，因缺乏有效的ASFV疫苗和治疗方法，ASF对我国养猪业造成了巨大损失。目前认为ASFV的入侵途径主要有网格蛋白介导的内吞途径(CME)和巨胞饮途径。有报道指出CD163是ASFV入侵的受体。但Popescu等的研究表明该受体在某些情况下对于ASFV感染不是必需的。因此参与病毒进入细胞的受体身份目前仍未知的，对抗病育种的开展造成极大的困扰。病毒蛋白pE248R位于病毒内膜，其参与ASFV进入早期进程。ASFV通过CME或巨胞饮途径进入到细胞，需要从内吞途径形成的内体中脱模并被释放到胞质中。ASFV脱膜涉及多囊泡晚期内体中病毒体外层(外膜和蛋白衣壳)的损失，以及内膜与内体的后期融合，从而将裸核释放到细胞质中。其中pE248R与病毒的脱模密切相关。Rodríguez等使用pE248R缺陷病毒颗粒进行研究，其发现pE248R缺陷病毒的感染力至少降低了100倍，而pE248R蛋白的缺失既不影响病毒的结合，也不影响病毒的内化，但没有引起细胞病变，并能使早期和晚期的基因表达受到损害，这表明该蛋白对于病毒的感染和早期进入是必需的。而近期的研究也指出该蛋白参与内膜与多囊泡内体膜的融合，是核释放关键因素。Rosa26基因座是基因组中的安全位点，在多种物种中都得到保存，包括小鼠，人类，大鼠，猪，绵羊和兔子。猪Rosa26(pRosa26)基因座的序列已被完全鉴定，并且pRosa26启动子已被鉴定。该猪内源性启动子通过避免DNA甲基化而适于以高且稳定的方式驱动外源基因表达。因此pRosa26是合适的插入外源基因的位点。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种抗非洲猪瘟猪的制备方法，是利用CRISPR-Cas9系统介导的同源重组将表达针对病毒蛋白pE248R基因的sgRNA-Cas9基因片段敲入到猪Rosa26基因座中，以获得抗非洲猪瘟猪。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种猪Rosa26基因donor载体，将猪Rosa26基因的第1内含子敲入表达靶向非洲猪瘟病毒pE248R基因的sgRNA-Cas9序列；猪Rosa26基因第1内含子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述表达靶向非洲猪瘟病毒pE248R基因的sgRNA-Cas9基因序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供一种所述猪Rosa26基因donor载体的制备方法，具体制备方法包括：S1.利用猪细胞基因组DNA为模板扩增出3780bp的猪Rosa26基因第1内含子同源左臂；将表达特异性靶向病毒pE248R基因的sgRNA-Cas9基因与猪Rosa26基因第1内含子同源左臂融合，得到融合片段1；S2.利用猪细胞基因组DNA为模板扩增出1935bp的猪Rosa26基因第1内含子同源右臂；将融合片段1与猪Rosa26基因第1内含子同源右臂融合，得到融合片段2；S3.用SacII和SphI限制性内切酶分别对融合片段2和载体LoxPneoLoxP2PGK进行双酶切，然后连接得到猪Rosa26基因donor载体。进一步地，步骤S1所述猪Rosa26基因第1内含子同源左臂核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；步骤S2所述猪Rosa26基因第1内含子同源右臂核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。进一步地，用于扩增猪Rosa26基因第1内含子同源左臂的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.6～7所示；用于扩增猪Rosa26基因第1内含子同源右臂的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.9～10所示。进一步地，用于扩增靶向敲除病毒pE248R基因的sgRNA-Cas9基因的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.3～4所示。本专利技术提供一种CRISPR/Cas9打靶载体，其含有特异性靶向猪Rosa26基因第1内含子的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。进一步地，具体制备方法为：先根据sgRNA序列合成互补配对的如SEQIDNO.13～14所示的寡聚核苷酸px459-F和px459-R，再将寡聚核苷酸在94℃，5min，再35℃，10min后立即放冰上进行退火处理，最后将其与经限制性内切酶BbsI进行酶切过夜并回收的px459骨架载体连接。本专利技术还提供一种抗非洲猪瘟克隆猪的制备方法，将所述CRISPR/Cas9打靶载体与所述猪Rosa26基因donor载体共同转入猪成纤维细胞中，获得阳性细胞克隆；以阳性细胞克隆为核移植供体细胞，卵母细胞为核移植受体细胞；将克隆胚胎移入猪子宫内妊娠，获得基因敲入后的抗非洲猪瘟克隆猪。进一步地，所述CRISPR/Cas9打靶载体与猪Rosa26基因donor载体共同转入猪成纤维细胞的具体步骤为：CRISPR/Cas9打靶载体与猪Rosa26基因donor载体按物质的量1：1～4的比例混合，用电穿孔的方法将其转入1x106个猪成纤维细胞。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术首次在猪上利用CRISPR/Cas9技术介导同源重组，将对靶向敲除ASFVpE248R的sgRNA-Cas9系统敲入猪Rosa26基因中，使其稳定表达针对病毒蛋白的sgRNA-Cas9从而获得ASFV抗性，为猪利用CRISPR/Cas9技术介导同源重组进行基因编辑研究及抗非洲猪瘟育种研究奠定基础。附图说明图1是本专利技术中将猪Rosa26基因第1内含子替换成特异性靶向敲除病毒pE248R基因的sgRNA-Cas9基因的示意图；图2是本专利技术实施例1中猪Rosa26基因donor载体的构建流程图；图3是本专利技术实施例2中T7E1酶切法鉴定在猪成纤维细胞上px459质粒对基因组的切割情况；其中试验组为px459质粒转染后的猪成纤维细胞基因组，WT组为野生型猪成纤维细胞基因组；图4是本专利技术实施例4中新生仔猪的Westernblot检测结果图。具体实施方式下面结合附图进一步说明本专利技术的实施例，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪Rosa26基因donor载体，其特征在于，将猪Rosa26基因的第1内含子敲入表达靶向非洲猪瘟病毒pE248R基因的sgRNA-Cas9序列；所述猪Rosa26基因第1内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述表达靶向非洲猪瘟病毒pE248R基因的sgRNA-Cas9序列如SEQ IDNO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.猪Rosa26基因donor载体，其特征在于，将猪Rosa26基因的第1内含子敲入表达靶向非洲猪瘟病毒pE248R基因的sgRNA-Cas9序列；所述猪Rosa26基因第1内含子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述表达靶向非洲猪瘟病毒pE248R基因的sgRNA-Cas9序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种权利要求1所述猪Rosa26基因donor载体的制备方法，其特征在于，具体制备方法包括：
S1.利用猪细胞基因组DNA为模板扩增出3780bp的猪Rosa26基因第1内含子同源左臂；将表达特异性靶向病毒pE248R基因的sgRNA-Cas9基因与猪Rosa26基因第1内含子同源左臂融合，得到融合片段1；
S2.利用猪细胞基因组DNA为模板扩增出1935bp的猪Rosa26基因第1内含子同源右臂；将融合片段1与猪Rosa26基因第1内含子同源右臂融合，得到融合片段2；
S3.用SacII和SphI限制性内切酶分别对融合片段2和载体LoxPneoLoxP2PGK进行双酶切，然后连接得到猪Rosa26基因donor载体。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述猪Rosa26基因第1内含子同源左臂核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；步骤S2所述猪Rosa26基因第1内含子同源右臂核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，用于扩增猪Rosa26基因第1内含子同源左臂的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.6～7所示；用于扩增猪Rosa26基因第1内含子同源右臂的引物对的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：巨向红，雍艳红，陈圣威，照那木拉，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东;44