重组人组织型激肽释放酶及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物工程基因领域，具体涉及重组人组织型激肽释放酶及其制备方法。本发明专利技术将人组织型激肽释放酶经过密码子优化构建重组质粒，并以大肠杆菌作为宿主进行高密度发酵，最终通过变复性处理获得产量较高的人组织型激肽释放酶，为人组织型激肽释放酶实现工业化生产提供研究基础，使人组织型激肽释放酶在疾病治疗中具有良好的前景。

【技术实现步骤摘要】
重组人组织型激肽释放酶及其制备方法
本专利技术属于生物工程基因领域，具体涉及重组人组织型激肽释放酶及其制备方法。
技术介绍
蛋白酶在生物理化过程中起着极其重要的作用，自然界中的蛋白酶因氨基酸功能残基的不同被划分为四类：丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶(SerineProteases,又称SPs)因其在活性位点上的催化丝氨酸残基而得名。目前人体中已发现175种丝氨酸蛋白酶，其中绝大多数为分泌蛋白。经典的丝氨酸蛋白酶在C端具有特异性保守催化三联体(His、Asp、Ser)结构域，同时具有包括Ser-his-glu、Ser-lys/His、His-Ser-His和n端Ser等在内的多个活性位点。这类蛋白酶广泛存在于生物体中，参与细胞凋亡与分化、胚胎发育、免疫防御等多种重要的生物代谢与化学过程，发挥重要的生物学作用。目前研究较多的是消化过程必不可少的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；此外，在消化、凝血、补体等多个系统中不可或缺的调节因子、作为外源性和内源性凝血途径重要组成部分的凝血因子X和凝血因子XI、补体系统经典途径中的C1r和C1s、凝集素途径中的MASP都是丝氨酸蛋白酶超家族的重要成员；甚至中性粒细胞(NSPs)中都存在着丝氨酸蛋白酶，主要发挥组织降解和微生物杀灭作用；近年来，丝氨酸蛋白酶在癌症进展和转移中的作用也受到广泛关注。激肽释放酶(KLKs)是一类具有多种生理功能的丝氨酸蛋白酶。“激肽释放酶”一词最早是在20世纪30年代由Werle等人提出，用来描述人类胰腺中能够产生释放激肽的物质。目前研究表明，KLKs是一个有15种分泌型的丝氨酸蛋白酶的家族，可以根据在体内分布的差异区分为两个主要的群体：一是血浆激肽释放酶(也称为KLK1B)，参与血浆激肽形成；另一个是组织激肽释放酶(包括KLK1)，参与组织细胞分裂素的形成。两组KLKs在基质、理化性质和功能特性等方面都有所差异。现有研究结果表明KLK1对健康的心血管系统很重要，并且KLK1缺乏与心血管疾病和终末器官病理有关。重要的是，KLK1补给疗法在亚洲得到了广泛的应用，在亚洲，KLK1被用于治疗从急性缺血性中风(AIS)到糖尿病并发症(视网膜病变和肾脏疾病)的疾病，这些疾病均涉及微循环不良或组织缺血。此外，AIS的发病机制包括适应不良的免疫系统反应和复杂的炎症途径均可通过KLK1治疗来解决。急性缺血性中风(AIS)是全世界死亡和致残的主要原因，其最严重的形式是由脑部威利斯环岛主要分支的大血管闭塞引起的。西方国家目前可用于大血管闭塞的治疗策略涉及通过使用机械或药理学手段(例如组织血浆激活剂tPA)去除有害血块来快速恢复血流。KLK1负责激肽(缓激肽和激肽)的产生，激肽促进局部血管舒张和长期血管形成。此外，KLK1在临床上已被直接用于治疗与局部血流受损有关的多种疾病，包括AIS。中华人民共和国已批准从人尿液中分离出一种人KLK1，用于亚急性AIS治疗。现有技术中，利用酵母表达系统生产重组KLK1，由于酵母为真核细胞，重组表达操作复杂，并且由于种属差异，KLK1很难直接在酵母中表达，无法实现产业量化，使KLK1的应用受到限制。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供了重组人组织型激肽释放酶的制备方法，目的是为了解决现有技术中，利用酵母表达系统生产重组KLK1，由于酵母为真核细胞，重组表达操作复杂，并且由于种属差异，KLK1很难直接在酵母中表达，无法实现产业量化，使KLK1的应用受到限制的技术问题。本专利技术提供的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，具体技术方案如下：重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，将激肽释放酶目的基因亚克隆到载体质粒上，获得目的基因重组质粒；S2，将步骤S1中的目的基因重组质粒转化至大肠杆菌，获得重组KLK1大肠杆菌菌株；S3，将步骤S2中的重组KLK1大肠杆菌菌株进行高密度发酵，表达重组SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵体；S4，将步骤S3中重组SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵体进行变性处理和复性处理，获得重组人组织型激肽释放酶。在某些实施方式中，在步骤S1中，所述激肽释放酶目的基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示，所述激肽释放酶目的基因通过同源重组处理方法亚克隆到载体质粒上；所述载体质粒为pSUMO3质粒。在某些实施方式中，在步骤S1中，所述同源重组处理方法包括如下步骤：(1)利用引物1和引物2获得线性化激肽释放酶目的基因，所述引物1的碱基序列如SEQIDNO.2所示，所述引物2的碱基序列如SEQIDNO.3所示；(2)利用引物3和引物4获得线性化pSUMO3质粒，所述引物3的碱基序列如SEQIDNO.4所示，所述引物4的碱基序列如SEQIDNO.5所示；(3)将步骤(1)中的线性化激肽释放酶目的基因与步骤(2)中的线性化pSUMO3质粒进行同源重组反应。在某些实施方式中，在步骤S3中，所述高密度发酵的具体步骤如下：将重组KLK1大肠杆菌菌株接种至摇瓶进行扩大培养后，再转入发酵罐进行高密度发酵培养。在某些实施方式中，所述扩大培养的培养基为氨苄抗性的2×YT培养基，培养温度为37℃，培养基摇床的转速为220rpm；所述高密度发酵培养包括下列步骤：将扩大培养后的菌液按1:(50-100)比例接种于经过高温灭菌过的发酵基础培养基中进行通气，搅拌培养，初始培养条件包括：转速100-120rpm，通气量20-40L/min，罐压0.03-0.07MPa，pH6.8-7.2，温度35-39℃；当细菌密度增加，溶氧低于20％时，提高转速至200-400rpm，提高通气量至50-80L/min；当发酵OD600至30以上时，加入诱导剂，同时，将发酵罐温度由35℃-39℃降为25℃-27℃，继续培养至发酵结束；所述诱导剂为0.5mM异丙基硫代半乳糖苷。在某些实施方式中，在步骤S3中，所述重组SUMO3-KLK1融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。在某些实施方式中，在步骤S4中，重组SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵体经过变性处理获得蛋白变性液，所述蛋白变性液逐滴滴加到剧烈搅拌的复性液中，静止复性，所述复性液的成分为50mM的pH7.5-8.5Tris-HCl、0-700mM的L-Arg、0-700mM的GuHCl、0-20％的glycerol、0-250mM的NaCl、3.8mMGSH/1.2mMGSSG和0-1800mM的Sorbitol。在某些实施方式中，所述复性液的成分为50mM的pH8.0Tris-HCl、50mM的NaCl、500mM的GuHCl、3.8mMGSH/1.2mMGSSG和1800mM的Sorbitol；所述复性温度为4℃，所述复性的时间为24-48h。在某些实施方式中，在步骤S4中，复性后的蛋白液进行透析、镍亲和层析和反向镍柱亲和层析，获得纯化后的重组人组织型激肽释放酶。本专利技术还提供了重组人组织型激肽释放酶，根据上述方法制备的重组人组织型激肽释放本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1，将激肽释放酶目的基因亚克隆到pSUMO3载体质粒上，获得目的基因重组质粒；/nS2，将步骤S1中的目的基因重组质粒转化至大肠杆菌，获得重组KLK1大肠杆菌菌株；/nS3，将步骤S2中的重组KLK1大肠杆菌菌株进行高密度发酵，表达重组SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵体；/nS4，将步骤S3中重组SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵体进行变性处理和复性处理，获得重组人组织型激肽释放酶。/n

【技术特征摘要】
1.重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将激肽释放酶目的基因亚克隆到pSUMO3载体质粒上，获得目的基因重组质粒；
S2，将步骤S1中的目的基因重组质粒转化至大肠杆菌，获得重组KLK1大肠杆菌菌株；
S3，将步骤S2中的重组KLK1大肠杆菌菌株进行高密度发酵，表达重组SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵体；
S4，将步骤S3中重组SUMO3-KLK1融合蛋白的包涵体进行变性处理和复性处理，获得重组人组织型激肽释放酶。


2.根据权利要求1所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述激肽释放酶目的基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示，所述激肽释放酶目的基因通过同源重组处理方法亚克隆到pSUMO3载体质粒上。


3.根据权利要求2所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述同源重组处理方法包括如下步骤：
(1)利用引物1和引物2获得线性化激肽释放酶目的基因，所述引物1的碱基序列如SEQIDNO.2所示，所述引物2的碱基序列如SEQIDNO.3所示；
(2)利用引物3和引物4获得线性化pSUMO3质粒，所述引物3的碱基序列如SEQIDNO.4所示，所述引物4的碱基序列如SEQIDNO.5所示；
(3)将步骤(1)中的线性化激肽释放酶目的基因与步骤(2)中的线性化pSUMO3质粒进行同源重组反应。


4.根据权利要求1所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述高密度发酵的具体步骤如下：将重组KLK1大肠杆菌菌株接种至摇瓶进行扩大培养后，再转入发酵罐进行高密度发酵培养。


5.根据权利要求4所述的重组人组织型激肽释放酶的制备方法，其特征在于，所述扩大培养的培养基为氨苄抗性的2×YT培养基，培养温度为37℃，培养基摇床的转速为220rpm；
所述高密度发酵培养包括下列步骤：将扩大培养后的菌液按1:(50-100...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶昀，林克，
申请(专利权)人：宁波瑞林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33