耐高温毕赤酵母菌株制造技术

本发明专利技术涉及耐高温毕赤酵母菌株。具体地，本发明专利技术涉及突变的耐热巴斯德毕赤酵母（

【技术实现步骤摘要】
耐高温毕赤酵母菌株
本专利技术涉及微生物领域，更具体涉及突变的耐热巴斯德毕赤酵母菌株和用该菌株得到的重组菌株、生物催化剂等，以及用该菌株生产外源蛋白的方法。
技术介绍
随着基因操作技术的日臻成熟，生物表达系统的出现很快地迎合了世界各地科学家的需求，逐渐成为解决工业、农业以及医疗卫生等领域问题的主要手段之一。生物表达系统中尤以巴斯德毕赤酵母（PichiaPastoris）表达系统研究最为广泛，是20世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统。该系统相较其他表达系统，弥补了大肠杆菌表达系统不易表达复杂蛋白的限制以及植物、动物细胞表达系统周期长、操作繁琐、成本高的缺点，完善了酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）分泌效率低、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷，迅速成为各国科学工作者的研究宠儿。迄今为止，已有数百多种外源蛋白在此体系中成功表达，且数量在不断增加。由于毕赤酵母在工业微生物发酵中应用广泛，控温能耗问题使得耐高温酵母的需要越来越迫切。毕赤酵母的最适生长温度为30ºC，发酵诱导温度在28ºC以下，所以在工业发酵过程中需要大量的冷却水来保证酵母的正常发酵生产。利用高温酵母菌进行发酵生产可以在较高温度条件下实现菌株的正常生长与蛋白表达，从而减少生产中由于降温而产生的能耗费用。且对于耐高温酵母菌株来说，它们具有生长速度快，生产效率高、不易污染杂菌等优点。它们所合成的酶与适温同类酵母菌株产生的酶相比，高温时具有更好的酶活性。因此围绕耐高温酵母菌株的选育已经成为研究的热点。目前，耐高温酵母菌株的选育方法主要集中在自然筛选和高温驯化，也有研究者才用分子生物学手段来改造酵母菌，使耐高温酵母菌株的研究取得了显著进展。ARTP（常压室温等离子诱变技术）作为一种操作简易的新型诱变技术已被证明能快速且有效地突变酵母菌和细菌等微生物。但是，本领域仍然需要具有在较高温度下生长速度更快，具有更高生产效率的耐高温毕赤酵母。
技术实现思路
本研究采用ARTP诱变和高温驯化结合的方式解决了上述问题。本专利技术在实验室前期改造的毕赤酵母m316H（CGMCCNo.19221）的基础上，通过ARTP诱变的方法，得到了具有良好的耐高温性能的突变毕赤酵母菌株，该菌株能够高效地表达外源基因。具体地，本专利技术涉及以下方面。一方面，本专利技术涉及突变的耐热巴斯德毕赤酵母（PichiaPastoris）菌株，其在28-34ºC的发酵温度，特别是34ºC下相对于未突变的菌株的生长速度提高和/或外源蛋白生产能力提高。在一个具体实施方案中，本专利技术的耐热巴斯德毕赤酵母菌株具有CGMCCNo.18764的保藏号。本专利技术的耐热巴斯德毕赤酵母菌株在高温条件进行发酵，在发酵过程不需要加入冷却水来保证酵母的正常发酵生产，因此节约了能耗。在具体实施方案中，发酵温度可以是28-34ºC。特别是，在34ºC的高温下，本专利技术的耐热巴斯德毕赤酵母菌株相对于未突变的出发菌株的蛋白产量显著提高。具体地，其在相同条件下相对于未突变的对照菌株生产的蛋白量，可以提高10%至2倍，例如，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，110%，120%，130%，140%，150%，160%，170%，180%，190%，特别是124%。另一方面，本专利技术涉及重组巴斯德毕赤酵母菌株，其通过在上述突变的耐热巴斯德毕赤酵母菌株中引入编码外源蛋白的基因而获得。在一个实施方案中，所述外源蛋白是酶，例如甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL。另一方面，本专利技术涉及生产目标蛋白的方法，包括将编码所述目标蛋白的基因引入上述突变的耐热巴斯德毕赤酵母菌株，并且培养所述菌株以产生目标蛋白。或者，包括培养上述重组巴斯德毕赤酵母菌株以产生目标蛋白。在一个实施方案中，所述外源蛋白是酶，例如甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL。另一方面，本专利技术涉及生物催化剂，其包含上述突变的耐热巴斯德毕赤酵母菌株，其中引入了编码外源酶，例如甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL的基因。另一方面，本专利技术涉及上文所述菌株生产的外源蛋白。所述外源蛋白是酶，优选甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL。本专利技术还涉及重组微生物细胞，其中引入了源自上述突变的耐热巴斯德毕赤酵母菌株的菌内成分。在获得本专利技术的菌株后，可以通过常规技术分离其菌内成分，并且将所述成分引入其它微生物。引入所述成分的重组微生物细胞具有本专利技术所述菌株的优良性能。具体地，本专利技术的突变毕赤酵母菌株能够用于表达外源蛋白。在获得了本专利技术的突变毕赤酵母菌株后，可以将常用的表达载体引入其中，用于表达外源蛋白。例如，表达载体中可以包含启动子和终止子，在启动子和终止子之间具有多克隆位点，可以插入编码外源蛋白的基因。许多商业载体都可以用于本专利技术的突变毕赤酵母菌株中进行外源蛋白的表达。例如，分泌表达载体主要有：pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZαA、pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ、pGAPZa、pPIC3.5K等。在表达非酵母来源的外源蛋白时，某些物种的密码子可能在毕赤酵母中是稀有的密码子。因此，在引入表达载体时，可以先对编码外源蛋白的基因进行适合本专利技术的毕赤酵母的密码子优化，从而增加表达量。本专利技术的毕赤酵母可以表达多种外源蛋白，包括药用蛋白、来自植物、动物和细菌的各种酶、膜受体蛋白、含辅基的蛋白以及可用于研究晶体结构的蛋白等。本专利技术的表达外源酶组分的毕赤酵母还可以以全细胞作为生物催化剂。附图说明图1显示本专利技术的1#菌株以及对照菌株GS115和m316H在发酵0-72小时后的生长情况(OD600)。图2显示实施例3中各菌株在28ºC和34ºC下产生的酶活力的比较。图3显示28ºC（左）及34ºC（右）条件下本专利技术的1#菌与出发菌表达MDGL的蛋白电泳图。具体实施方式本专利技术以m316H菌株（CGMCCNo.19221）为出发菌株，通过ARTP诱变，并经高温筛选，获得了一株能在34ºC生长较快并且蛋白产量提高的突变菌株——毕赤酵母FY1H菌株。专利技术人用MDGL基因对FY1H菌株进行摇瓶评估，发现在28ºC条件下发酵，MDGL酶活与出发菌株m316H相当，较GS115提高了15%。经过诱变所得的宿主菌1#，升温发酵，产量比出发菌株提高了124%，比m1-1H提高了130%，比低温下的m1-1H产量提高12%。即，本专利技术提供了一株能高温条件下发酵产酶性能显著提高的毕赤酵母菌株。该毕赤酵母可以在高温条件进行发酵，降低发酵过程中的能耗，且表达的外源蛋白具有酶活高、蛋白量高等优点。实验材料1)实验菌株和质粒实验菌株：GS115(购于Invitrogen公司)、m316H（于2019年12月19号保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.突变的耐热巴斯德毕赤酵母（

【技术特征摘要】
1.突变的耐热巴斯德毕赤酵母（PichiaPastoris）菌株，其在28-34ºC，特别是34ºC的发酵温度下相对于未突变的菌株生长速度和/或外源蛋白生产能力提高。


2.权利要求1的耐热巴斯德毕赤酵母菌株，其保藏号为CGMCCNo.18764。


3.重组巴斯德毕赤酵母菌株，其通过在权利要求1或2的菌株中引入编码外源蛋白的基因而获得。


4.权利要求3的重组巴斯德毕赤酵母菌株，其中所述外源蛋白是酶，优选甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL。


5.生产目标蛋白的方法，包括将编码所述目标蛋白的基因引入权利要求1或2的菌株，并且培...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹海生，戴小军，吴伟，牛其文，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31