一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用。所述杂交瘤细胞保藏号为CCTCC NO：C202148，分泌的鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗，具有较高的效价，且具有较强的特异性。使用制备的单抗建立了一种以纯化的重组NDRV σB蛋白作为包被抗原，HRP标记的抗σB蛋白单抗作为检测抗体的阻断ELISA，该方法能特异性地识别NDRV阳性血清，而与其它鸭、鹅常见病抗体阳性血清无交叉反应；重复性试验表明，批间和批内的变异系数均小于10％；敏感性为90.5％，特异性为94.5％，且与病毒中和试验的符合率为93.8％。

【技术实现步骤摘要】
一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用。
技术介绍
鸭呼肠孤病毒(duckreovirus，DRV)分为两种基因型，即I型和II型。基因I型为经典型鸭呼肠孤病毒(classicalDRV，CDRV)，即番鸭呼肠孤病毒(Muscoveyduckreovirus，MDRV)，该病毒主要感染番鸭和半番鸭，引起鸭坏死性肝炎(俗称番鸭“白点病”或“花肝病”)，以肝脾等脏器出现大量粟粒状坏死灶为病理特征，该病自1997以来在我国南方广东、广西、福建、浙江和江西等广泛流行；基因II型为鸭新型呼肠孤病毒(novelDRV，NDRV)，该病毒可引起番鸭、半番鸭、北京鸭和鹅等水禽发病，其特征性病变为肝脾出现严重的坏死和出血(俗称“出血性坏死性肝炎”或“脾出血坏死症”)，该病最早发生于2000年，此后开始在我国的江苏、浙江、福建、广东、河北、山东等省暴发与流行。目前，基因II型(NDRV)已成为我国流行的优势基因型。NDRV基因组由10个节段的双链RNA构成，全长23419bp。病毒粒子由二十面体对称的双层衣壳组成，直径70nm、无囊膜。依据SDS-PAGE电泳结果均可将基因组分为3个群，分别是：L组群(L1，L2，L3)，M组群(M1，M2，M3)和S组群(S1，S2，S3，S4)。σB是NDRV主要的核衣壳组成成分和外衣壳蛋白，其功能与哺乳动物呼肠孤病毒(Mammalianreovirus，MRV)的σ3蛋白和ARV及CDRV的σB蛋白相似，诱导宿主机体产生群特异性中和抗体。ARV与CDRV的σB蛋白之间存在保守的免疫原性区及群特异性抗原表位。NDRV与CDRV为DRV不同的基因型，而DRV与ARV均属于禽正呼肠孤病毒种群成员；NDRVσB蛋白与ARV及CDRV的σB蛋白氨基酸同源性分别约60％和70％。目前，NDRV的主要检测方法有病毒分离、RT-PCR、病毒中和试验(VNT)和间接ELISA([1]陈仕龙，陈少莺，程晓霞，江斌，林峰强，王劭，朱小丽，李兆龙，张世忠。3种禽类呼肠孤病毒血清学相关性及致细胞病变差异分析.畜牧兽医学报，2011，42(4)：533-537.[2]YunT，ChenHP，YuB，ZhangC，ChenL，NiZ，HuaJG，YeWC.DevelopmentandapplicationofanindirectELISAforthedetectionofantibodiestonovelduckreovirus.JournalofVirologicalMethods，2015，220：55-59.)等。其中ELISA方法对于抗原和抗体均可检测，且该方法操作简单、快速、易批量化、以及灵敏性高和特异性强等特点，已成为病原流行病学调查抗体检测的首选方法。现有研究表明，各品种的鸭及鹅均可被NDRV感染及致病，而目前又没有一种商品化的广谱抗不同品种鸭及鹅的通用型血清二抗，这给NDRV病的血清学诊断带来诸多不便。
技术实现思路
目前NDRVσB蛋白的表位抗原性以及是否存在群特异性抗原表位还不清楚。因此，本申请利用原核表达的重组σB蛋白作为免疫原制备了针对NDRVσB蛋白的特异性单克隆抗体(MAb)，可用于NDRV特异性检测。本专利技术首先提供了一种分泌鸭新型呼肠孤病毒(novelduckreovirus)σB蛋白单抗的杂交瘤细胞，为小鼠(Musmusculus(Mouse))杂交瘤细胞(脾脏细胞×骨髓瘤细胞(SP20))，分类命名为杂交瘤细胞株NDRVYT2-C10，保藏号为CCTCCNO：C202148，保藏日为2021年3月24日，保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。本专利技术又提供了一种鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗，由保藏号为CCTCCNO：C202148的杂交瘤细胞分泌。本专利技术又提供了所述鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗在制备检测鸭新型呼肠孤病毒的试剂盒中的应用。本专利技术又提供了一种用于鸭新型呼肠孤病毒抗体阻断ELISA检测的试剂盒，包括：(1)经标记物标记的所述鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗；(2)鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白。常用于ELISA的标记物有HRP(辣根过氧化物酶)和AP(碱性磷酸酶)，两者的催化底物和反应终止液根据各自酶种类进行选择。所述的试剂盒，还包括：封闭液、TMD底物显色液、显色终止液。这些试剂可以使用现有技术中ELISA检测时常用的成分。比如，封闭液可以使用一定浓度的BSA蛋白、脱脂奶粉或者明胶等。显色终止液可以使用一定浓度的硫酸溶液。本专利技术又公开了所述试剂盒在禽类接种鸭新型呼肠孤病毒疫苗后的免疫状况评估中的应用。本专利技术试剂盒还可以用于鸭新型呼肠孤病毒疫病的血清学监测，或者爆发过鸭新型呼肠孤病毒疫病的环境经处理后进行检测以确认安全。本专利技术还提供了一种非疾病诊断为目的、用于鸭新型呼肠孤病毒抗体阻断ELISA检测的方法，包括以下步骤：(1)使用鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白包被ELISA板，然后洗涤去除多余的鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白；(2)使用封闭液进行封闭，封闭后洗涤去除多余封闭液；(3)加入待测血清样本孵育，孵育后洗涤去除待测血清样本中未结合的物质；(4)加入经HRP标记的权利要求2所述鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗孵育，孵育后加入TMD底物显色液进行显色；(5)显色后加入显色终止液终止显色，并用酶标仪读取ELISA板中各孔的OD450nm值；(6)计算阻断率PI，PI＝(1-被检血清OD450nm/阴性血清OD450nm)×100％，根据阻断率值判断待测血清样本为鸭新型呼肠孤病毒阳性或阴性。判断待测血清样本为鸭新型呼肠孤病毒阳性或阴性时使用的阻断率值标准可以根据具体情况进行简单的摸索确定。本专利技术还提供了所述的方法在禽类接种鸭新型呼肠孤病毒疫苗后的免疫状况评估中的应用。本专利技术方法还可以用于鸭新型呼肠孤病毒疫病的血清学监测，或者爆发过鸭新型呼肠孤病毒疫病的环境经处理后进行检测以确认安全。本专利技术制备获得了一种分泌鸭新型呼肠孤病毒(novelduckreovirus)σB蛋白单抗的杂交瘤细胞，制备获得了鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗，具有较高的效价，且具有较强的特异性。使用制备的单抗建立了一种以纯化的重组NDRVσB蛋白作为包被抗原，HRP标记的抗σB蛋白单抗作为检测抗体的阻断ELISA，该方法能特异性地识别NDRV阳性血清，而与其它鸭、鹅常见病抗体阳性血清无交叉反应；重复性试验表明，批间和批内的变异系数均小于10％；敏感性为90.5％，特异性为94.5％，且与病毒中和试验的符合率为93.8％。附图说明图1为重组σB蛋白SDS-PAGE检测结果图，其中，泳道M：蛋白分子Marker；1：未诱导的重组菌体；2：诱导的pET-SUMO-σB菌液；3：诱导后的全菌裂解上清；4：裂解后的菌体沉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌鸭新型呼肠孤病毒(novel duck reovirus)σB蛋白单抗的杂交瘤细胞，其特征在于，分类命名为杂交瘤细胞株NDRV YT 2-C10，保藏号为CCTCC NO：C202148。/n

【技术特征摘要】
1.一种分泌鸭新型呼肠孤病毒(novelduckreovirus)σB蛋白单抗的杂交瘤细胞，其特征在于，分类命名为杂交瘤细胞株NDRVYT2-C10，保藏号为CCTCCNO：C202148。


2.一种鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗，其特征在于，由权利要求1所述杂交瘤细胞分泌。


3.权利要求2所述鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗在制备检测鸭新型呼肠孤病毒的试剂盒中的应用。


4.一种用于鸭新型呼肠孤病毒抗体阻断ELISA检测的试剂盒，其特征在于，包括：
(1)经标记物标记的权利要求2所述鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗；
(2)鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，标记物为HRP或AP。


6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括：封闭液、TMD底物显色液、显色终止液。


7.权利要求4～6任一所述试剂盒在禽类接种鸭新型呼...

【专利技术属性】
技术研发人员：云涛，张存，华炯钢，叶伟成，陈柳，倪征，朱寅初，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33