抗仿刺参卵壳基质蛋白的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种抗仿刺参卵壳基质蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明专利技术通过鉴定ECMP(BAJ41227.1)为仿刺参性别鉴定标记物并据此制备相应单克隆抗体V2F5C8，基于该单克隆抗体有效通过体腔液上清鉴定仿刺参性别，特异性强、准确度高，同时还具有高通量、快速检测等优势。

【技术实现步骤摘要】
抗仿刺参卵壳基质蛋白的单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及单克隆抗体
，具体涉及一种抗仿刺参(Apostichopusjaponicus)卵壳基质蛋白的单克隆抗体。
技术介绍
仿刺参属于棘皮动物门、海参纲、楯手目、刺参科、仿刺参属，是我国海水养殖的支柱性品种之一，也是我国海水养殖产业中单一品种产值最高的品种。仿刺参为雌雄异体动物，在自然条件下，其雌性和雄性个体数量的比例接近1:1。肉眼可观察到的仿刺参雌性和雄性个体最显著的表型区别为：①雌性个体繁殖期排出的卵子在水中呈橘红色，雄性个体繁殖期排出的精子在水中呈乳白色；②雌性个体繁殖期解剖后体内的性腺呈橘红色，雄性个体繁殖期解剖后体内的性腺呈乳白色。然而，从外观性状上难以判断仿刺参的性别。在仿刺参的人工育苗生产中，主要通过产卵、排精时水中的卵子和精子颜色来判定仿刺参性别。仿刺参的人工育苗生产通常选择外海采捕的大规格仿刺参(>200g)作为种参，其价格高昂，是普通商品参价格的数倍。并且，仿刺参的人工育苗生产要求种参中雌性个体比例高于雄性，通常雌雄数量比在2:1～10:1，过高的雄性种参比例会影响受精效率。为了保证育苗生产中雌性种参的数量，育苗生产企业或单位只能过量购买种参，然后在种参产卵、排精的过程中鉴定种参性别并挑出多余的雄性种参，从而造成了资源的浪费和育苗成本的高企。另外，在仿刺参的人工育苗生产中，虽然有干露、升温等措施刺激种参同步产卵和排精，但种参个体之间的产卵和排精并不十分同步，这一过程往往从前一日23时左右持续至次日凌晨3时左右，生产和技术人员在此期间需要持续观察和鉴别种参性别、调整雌雄种参的比例在适当范围内，给生产和技术人员造成了繁重的劳动负担。目前已报道的仿刺参种参性别鉴定技术主要包括医用超声波扫描鉴定技术、体腔液PAGE鉴定技术、麻醉后负压采集种参部分性腺组织观察鉴定技术等，但这些技术都存在高通量检测的局限，不适用于对大量的仿刺参种参开展性别快速鉴定，无法解决仿刺参育苗生产中种参过量采购和工作人员种参性别鉴定工作任务繁重的问题。酶联免疫吸附测定(ELISA)是实现大批量仿刺参种参样品性别快速鉴定的可行技术。能够实现仿刺参种参性别高通量、快速检测的ELISA技术高度依赖仿刺参性别差异标志物及其特异性抗体。有鉴于此，提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗仿刺参卵壳基质蛋白的单克隆抗体及其制备方法，为实现仿刺参种参性别的高通量、快速检测提供重要的工具，从而弥补现有技术的不足。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术首先提供了一种杂交瘤细胞株，命名为V2F5C8，所述杂交瘤细胞株V2F5C8保藏编号为：CCTCCNO：C2020258，于2021年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉。本专利技术还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株分泌。进一步的，所述抗体不做限制，可以是IgG型、IgM型、IgA型、IgE型或IgD型任一种。本专利技术还提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述单克隆抗体。本专利技术还提供了一种组合物或复合物，所述组合物或复合物包含上述抗体或其序列等。本专利技术还提供了一种上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在仿刺参性别鉴定中的应用。本专利技术还提供了一种上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备仿刺参性别鉴定试剂或试剂盒中的应用。本专利技术还提供了一种仿刺参性别鉴定试剂盒，所述试剂盒包含上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体。进一步的，所述试剂盒可以为ELISA试剂盒，或WB试剂盒；优选的，上述单克隆抗体经ELISA检测显示：抗体能与ECMP(BAJ41227.1)的25-492aa肽段结合，且能够通过体腔液上清鉴定仿刺参的性别；而经western-blot检测显示：抗体能与分子量约为54kDa的ECMP(BAJ41227.1)的25-492aa肽段以及雌性仿刺参体腔液上清中的分子量约为77kDa的ECMP(BAJ41227.1)结合。本专利技术还提供了一种上述单克隆抗体制备方法，是利用上述杂交瘤细胞株分泌制备；或者利用ECMP(BAJ41227.1)的25-492aa肽段小鼠免疫制备。优选的，比如包括以下具体步骤：(1)从Genbank获得仿刺参ECMP(BAJ41227.1)的cDNA序列和氨基酸序列，分析ECMP(BAJ41227.1)的抗原表位和序列特异性，确定25-492aa肽段抗原效果和序列特异性最佳；(2)根据大肠杆菌密码子偏好性优化密码子，基因合成经过密码子优化的ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段对应的cDNA序列，设计带有BamHI和XhoI酶切位点的引物并以合成的cDNA为模板进行通过PCR扩增，纯化PCR产物后将PCR产物连接pET-28a载体并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，利用IPTG诱导大肠杆菌表达带6×His标签的25-492aa肽段，通过亲和层析纯化得到带6×His标签的25-492aa肽段；(3)以带6×His标签的25-492aa肽段为抗原免疫Balb/C小鼠；(4)通过PEG介导的细胞融合制备杂交瘤细胞，经免疫学检测筛选得到分泌抗ECMP(BAJ41227.1)单克隆抗体的杂交瘤细胞V2F5C8，利用常规培养方法培养上述得到的杂交瘤细胞V2F5C8，收集细胞培养上清液，得到鼠抗仿刺参卵壳基质蛋白单克隆抗体。本专利技术还提供了一种仿刺参性别鉴定方法，其特征在于，利用上述单克隆抗体进行仿刺参性别鉴定，或利用上述试剂盒进行仿刺参性别鉴定。本专利技术还提供了一种制备上述单克隆抗体的分离的抗原片段，所述分离的抗原片段为Genbank号BAJ41227.1的ECMP氨基酸的第25-492AA肽段；优选的，所述分离的抗原片段编码序列如SEQIDNO.1所示，其实经密码子优化后序列。本专利技术还提供了一种ECMP蛋白在仿刺参性别鉴定中的应用，该ECMP蛋白可作为仿刺参性别鉴定标记物，进一步的，所述ECMP蛋白为ECMP(genbank号为BAJ41227.1)；更近一步的，通过ECMP蛋白的抗体进行仿刺参性别鉴定，比如ELISA或WB试验。本专利技术的有益技术效果：1)本专利技术首次提出ECMP(BAJ41227.1)可作为仿刺参性别鉴定的标记物；2)本专利技术制备的单克隆抗体V2F5C8能够通过体腔液上清鉴定仿刺参的性别，具有良好的特异性；3)基于本专利技术单克隆抗体V2F5C8建立的ELISA检测试剂盒能够准确检测出测仿刺参性别，准确度大于93％，且具有高通量、快速检测等显著优势，弥补现有技术不足，适于产业推广；4)本专利技术抗体制备方法，通过选择ECMP(BAJ41227.1)的25-492aa肽段作为免疫原，具有抗原效果和序列特异性最佳优势，能够制备出高特异性抗体，避免与其他ECMP蛋白交叉，有效应用于仿刺参性别鉴定性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株V2F5C8，其特征在于，所述杂交瘤细胞株V2F5C8保藏编号为：CCTCC NO：C2020258。/n

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株V2F5C8，其特征在于，所述杂交瘤细胞株V2F5C8保藏编号为：CCTCCNO：C2020258。


2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌；优选的，所述抗体为IgG型、IgM型、IgA型、IgE型或IgD型任一种。


3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求2所述单克隆抗体。


4.一种组合物或复合物，其特征在于，所述组合物或复合物包含权利要求2所述抗体。


5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在仿刺参性别鉴定中的应用，或在制备仿刺参性别鉴定试剂中的应用。


6.一种仿刺参性别鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述杂交瘤细胞株或权利要求2所述单克隆抗体，优选的，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋经伟，高杉，赵泽龙，陈仲，关晓燕，姜北，王摆，孙红娟，王旭达，董颖，周遵春，
申请(专利权)人：辽宁省海洋水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21