一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养液制造技术

本发明专利技术的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养液，包括第一阶段培养液和第二阶段培养液，所述第一阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L‑Glutamine、β‑巯基乙醇、SU6656、Retinoic acid、CHIR99021、hEGF和NKH477；第二阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L‑Glutamine、β‑巯基乙醇、BMP4和抗坏血酸。本发明专利技术的培养液可以在较短时间内获得由诱导多功能干细胞来源的成熟内皮细胞，此方法获得的初级角质细胞和成熟角质细胞纯度好、活率高、功能完善，具有潜在的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养液
本专利技术属于细胞工程
，具体来说是一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养液。
技术介绍
目前皮肤作为一个最大的人体器官，也是人体第一道屏障，具有阻止病原菌的入侵、防止机体脱水、调节体温和提供感知等多种作用。角质细胞位于复层上皮最深的基底层，有时被称为基底细胞或基底角质形成细胞。已知表皮中95％的细胞为角质细胞，鳞状角质形成细胞也存在于口腔和食道的粘膜，以及角膜、结膜和生殖器上皮细胞等也属于角质细胞。角质细胞维持表皮分化的各个阶段，并负责与皮肤的神经形成紧密连接(Tightjunctions)。它们还能支持真皮、表皮和淋巴细胞的朗格汉斯细胞(Langerhanscells)。角质形成细胞除了其结构作用外，还在免疫系统功能中发挥作用。皮肤作为第一道防线，角质形成细胞是生物体与其环境之间的屏障。除防止毒素和病原体进入生物体体内外，它们还防止体内水分、热量和其他重要成分的流失。同时，负责在没有损伤的情况下分泌抑制性细胞因子，刺激炎症应激，并激活朗格汉斯细胞(Langerhanscells)对损伤的反应。当皮肤感染时，朗格汉斯细胞作为抗原提呈细胞，是第一批处理微生物抗原从皮肤破裂位点进入身体的细胞。在生物体中，角质形成细胞依靠表皮基底层中的干细胞进行替代和补充。角质细胞产生的化合物和其他蛋白质对于皮肤最外层角质层的完整性十分关键，可是角质形成细胞是死亡的鳞状细胞，不具有繁殖能力。一旦角质细胞到达角质层，就会被角质化，形成坚韧的皮肤即角质层，被认为具有防御微生物入侵的主要作用，同时也作为免疫反应的激活剂。表皮中具有抗原提呈作用的细胞类群，能够在适当的条件下激活T淋巴细胞，以适应细胞和体液免疫反应。其中发挥主要作用的是朗格汉斯细胞，但角质形成细胞在特殊条件下也会发挥作用。当前，角质形成细胞已可被单独或与其他成分一起作为皮肤植入物。因此，鉴于角质细胞形成物理屏障的作用和产生抗菌肽的能力而被广泛用于细胞治疗。大面积的烧伤和如糖尿病、血管病、肥胖、慢性伤口损伤等疾病因为缺乏有效的治疗手段、治疗效果差以及花费巨大等原因已成为全球性难题。细胞移植治疗对上述问题来讲是当前最为及时和有效的一种治疗方式，通常采用患者自身角质干细胞进行体外增殖，以获得足够量的细胞。然而，此方式最大的弊端在于，获得足够多的干细胞通常需要较长的周期，而这么长的周期可能会导致患者机体脱水和感染。此外，还存在免疫排斥反应的问题，移植的表皮细胞可能会被快速排斥掉。为了克服这样的难题，初期有研究者尝试提出使用惰性或生物合成的基质，但是这些都会因为快速的移植排斥反应和因为含有异种胶原和成体异源皮肤细胞导致的疾病而被放弃。多能干细胞，包括胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)和诱导多能干细胞(inducedPlurpotentStemCells，iPSCs)为该种治疗模式带来了希望。因为多能干细胞可以无限增殖，而且具有可以分化为任意细胞类型的多能性，所以被广泛用于开发临床可用的细胞治疗产品。尽管已有报道表明胚胎干细胞可以分化成角质细胞，但是其增殖潜能较低，不能大规模复制。后来，一些细胞因子短期诱导的方法也被用于将hESCs向角质细胞分化。然而产生有功能的基底角质细胞仍然有一定难度。并且，鉴于hiPSCs对比hESCs的伦理上的优势，从iPSCs来源的角质细胞的临床应用和转化更具有意义。
技术实现思路
1.专利技术要解决的技术问题本专利技术的目的在于解决现有的由多能干细胞诱导分化角质细胞的方法中存在制备周期长、获得产率和纯度低、以及获得细胞功能不全等技术问题。2.技术方案为达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：本专利技术的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养液，包括第一阶段培养液和第二阶段培养液，所述第一阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇、SU6656、Retinoicacid、CHIR99021、hEGF和NKH477；第二阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇、BMP4和抗坏血酸。优选的，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中DMEM/F12基础培养液的体积比为1:0.9～1.3，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中KOSR的浓度为15％-30％，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中的非必须氨基酸NEAA的浓度为1％，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中L-Glutamine的浓度为0.5-1mM，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中β-巯基乙醇的浓度为0.05-1.20mM。优选的，所述第一阶段培养液中SU6656的浓度为3-10μM、视黄酸Retinoicacid(RA)浓度为0.5-2μM、CHIR99021浓度为5-20mM、hEGF浓度为8-16ng/mL、NKH477浓度为0.05-0.2mM。优选的，所述第二阶段培养液中BMP4浓度为0.05-0.8nM、抗坏血酸浓度为0.05-2μM。优选的，所述DMEM/F12基础培养液的体积比为1:1，所述KOSR的浓度为20％，所述L-Glutamine的浓度为1mM，所述β-巯基乙醇的浓度为0.1mM。优选的，所述SU6656的浓度为6μM、视黄酸Retinoicacid(RA)浓度为1μM、CHIR99021浓度为10mM、hEGF浓度为10ng/mL、NKH477浓度为0.1mM.优选的，所述BMP4浓度为0.6nM、抗坏血酸浓度为1μM。3.有益效果采用本专利技术提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下有益效果：本专利技术的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养液，包括第一阶段培养液和第二阶段培养液，所述第一阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇、SU6656、Retinoicacid、CHIR99021、hEGF和NKH477；第二阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇、BMP4和抗坏血酸。本专利技术的培养液可以在较短时间内获得由诱导多功能干细胞来源的成熟内皮细胞，此初级角质细胞和成熟角质细胞纯度好、活率高、功能完善，具有潜在的临床应用价值。附图说明图1为本专利技术的角质细胞制备流程图；图2为本实施例2的流式细胞术检测表面标志物(K18)结果示意图；图3为本实施例3的流式细胞术检测表面标志物(K14)结果示意图；图4为本专利技术的人诱导多能干细胞形态图代表例；图5为本专利技术的初级角质细胞形态图代表例；图6为本专利技术的成熟角质细胞形态图代表例；图7为实施例4-7的初级角质细胞流式细胞术检测表面标志物(K18，p63)结果示意图；图8为实施例8-11的成熟角质细胞流式细胞术检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养液，其特征在于：包括第一阶段培养液和第二阶段培养液，所述第一阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇、SU6656、Retinoic acid、CHIR99021、hEGF和NKH477；第二阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇、BMP4和抗坏血酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养液，其特征在于：包括第一阶段培养液和第二阶段培养液，所述第一阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇、SU6656、Retinoicacid、CHIR99021、hEGF和NKH477；第二阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇、BMP4和抗坏血酸。


2.根据权利要求1所述的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养液，其特征在于：所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中DMEM/F12基础培养液的体积比为1:0.9～1.3，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中KOSR的浓度为15％-30％，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中的非必须氨基酸NEAA的浓度为1％，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中L-Glutamine的浓度为0.5-1mM，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中β-巯基乙醇的浓度为0.05-1.20mM。


3.根据权利要求1所述的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养液，其特征在于：所述第一阶段培养液中SU6656的浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：高歌，周安宇，
申请(专利权)人：上海爱萨尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31