自体皮肤成纤维细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了自体皮肤成纤维细胞的制备方法，方法步骤如下：S1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于组织处理液中10‑20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎；S2：将剪碎后的组织加入37℃预热的的混合酶消化液进行消化，消化结束后加入终止消化液以终止消化；S3：将所得组织液合并至离心管中，离心，去除上清，向细胞沉淀加入细胞培养液，得到P

【技术实现步骤摘要】
自体皮肤成纤维细胞的制备方法
本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及自体皮肤成纤维细胞的制备方法。
技术介绍
皮肤是包被在肌肉外面的组织，覆盖全身，是人体的最大的器官，可分为表皮、真皮和皮下组织三层，并包含脂腺、汗腺、毛发、指(趾)甲等附属器官。皮肤成纤维细胞(fibroblast，Fbs)是构成皮肤真皮的主要结构成分，可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、透明质酸等细胞外基质，对于保持皮肤强度和弹性、修复损伤及美容美体具有重要作用。其正常的增值分化是维持皮肤正常的结构和生理功能。人随着年龄的增长，皮肤成纤维细胞数量越来越少，活性越来越低，相应的其产生的胶原蛋白、弹性纤维、透明质酸这些物质就会减少，不足以支撑皮肤结构，导致真皮层变薄，皮肤开始松弛，失去弹性，出现皱纹。补充成纤维细胞能够从根源上解决面部皮肤衰老及损伤问题，让皮肤从初代细胞开始重生，因此，关于皮肤成纤维细胞的研究越来越受到人们的关注。现有的提取皮肤成纤维细胞尚有诸多缺点，例如消化时间长，操作步骤繁琐，进而显示出这些方法不够简便高效。例如CN1569258(中国专利申请号03150373.X，公开日2005年01月26日)公开的题为“组织工程自体复合皮肤及其制备方法”的专利技术；CN110438067A(中国专利申请号201910777323.4，公开日2019年11月12日)公开的题为“人皮肤成纤维细胞及其制备方法”的专利技术；CN106176561A(中国专利申请号201610570608.7，公开日2016年12月07日)公开的题为“一种自体皮肤成纤维细胞用于美容抗衰的制备方法”的专利技术；CN109294981A(中国专利申请号201811304237.3，公开日2019年02月01日)公开的题为“一种人皮肤成纤维细胞提取方法及其培养基”的专利技术。以上专利存在消化时间长或需要消化两次及以上，或是消化后需要过滤，操作步骤繁琐，极易因人为的操作导致污染。因此，需要研究一种与常规方法相比更高简化、更高效及更高经济效益，能足够工业应用之程度的方法，以获取纯度高、数量多、活性好、可传代次数高的皮肤成纤维细胞，这具有非常重要的意义和积极的应用前景。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了自体皮肤成纤维细胞的制备方法，采用多种酶的混合消化液，可直接进行消化，操作过程简单，耗时短，且可得到纯度高、数量多、活性好、可传代次数高的皮肤成纤维细胞。本专利技术提出的自体皮肤成纤维细胞的制备方法，方法步骤如下：S1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于组织处理液中10-20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎；S2：将剪碎后的组织加入37℃预热的含Hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液进行消化，消化结束后加入终止消化液以终止消化；S3：将所得组织液合并至离心管中，离心，去除上清，向细胞沉淀加入细胞培养液，重悬至3-15ml作为原代细胞，后转移至培养皿培养，得到P0成纤维细胞；S4：将P0代细胞接种至培养瓶中，培养结束后收集细胞，得到P1代成纤维细胞，取样并计数细胞的数量和活率。优选地，所述S1中组织处理液为含有0.8-1.2％双抗的0.9％生理盐水。优选地，所述S1中剪碎后组织的大小为0.1-0.3mm3。优选地，所述S2中复合酶包含如下重量份原料：dispase酶0.1-5份、DNA酶0.2-2份、胶原酶Ⅱ0.1-3份、胶原酶Ⅳ0.1-3份、透明质酸酶0.1-3份。优选地，所述S3中离心的条件为：时间3-5min、转速1200-1800rpm。优选地，所述S3中培养的条件为：温度37℃、5％CO2培养箱中培养。优选地，所述S3中细胞培养液为包含B-27、bFGF和EGF的DMEM/F12培养基。优选地，所述B-27、bFGF和EGF的质量比为0.3-0.7:1:1-1.5。本专利技术提出的上述方法制备的自体皮肤成纤维细胞。与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果：(1)本专利技术的制备方法，代替了传统消化方式；传统胰酶在进行消化时，一般采用37℃消化6-7小时，耗时较长，并且对于不同人、不同状态的皮肤组织，胰酶易出现细胞过度消化或消化不足，导致细胞损失、损伤的情况，而该法通过采用混合酶(其中包括dispase酶、DNA酶、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶)消化的方式，在摇床37℃、80rpm震荡仅30分钟后，即可实现目标细胞之间、目标细胞与杂细胞或纤维等等之间的分离。此外采用本申请的复合酶能够完全将组织消化，节省了过滤步骤。附图说明图1为本专利技术提出的实施例1制备的原始成纤维细胞；图2为本专利技术提出的实施例2制备的原始成纤维细胞；图3为本专利技术提出的实施例3制备的原始成纤维细胞。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解说。实施例1本专利技术提出的自体皮肤成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：S1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于1％双抗的0.9％生理盐水混合的组织处理液中20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎，剪碎得到的皮肤组织大小约为0.1mm3；S2：取0.5mldispase酶、1.0mlDNA酶、0.5ml胶原酶Ⅱ、0.5ml胶原酶Ⅳ、1.0ml透明质酸酶混合，加入Hank’s平衡盐溶液，制备得到混合酶溶液，对其进行37℃预热；S3：将剪碎后的组织加入7ml含Hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液中，摇床37℃、80rpm震荡消化30min，消化结束后加入终止消化液以终止消化；S4：将上一步骤所得组织液合并分装至离心管中，离心5min，转速1500rpm:，弃上清；S5：将所得细胞沉淀加入包含有20ng/mlB-27、30ng/mlbFGF和35ng/mlEGF的DMEM/F12培养液，重悬至5ml作为原代细胞，后转移至60mm培养皿中在37℃、5％CO2培养箱中进行培养，得到原始成纤维细胞(P0代)图1。S6：培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到70～80％左右，传代，将P0代细胞接种至4个T75培养瓶中。培养过程中3天换液一次，直至细胞融合率达到80％以上，收集细胞，得到P1代成纤维细胞，取样并计数细胞的数量和活率(得到2.3*10^7数量的成纤维细胞，活性为97.3％)。实施例2本专利技术的自体皮肤成纤维细胞的制备方法，包括以下步骤：S1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于1％双抗的0.9％生理盐水混合的组织处理液中20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎，剪碎得到的皮肤组织大小约为0.2mm3；S2：取1.0mldispase酶、0.5mlDNA酶、0.7ml胶原酶Ⅱ、1.5ml胶原酶Ⅳ、0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.自体皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：/nS1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于组织处理液中10-20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎；/nS2：将剪碎后的组织加入37℃预热的含Hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液进行消化，消化结束后加入终止消化液以终止消化；/nS3：将所得组织液合并至离心管中，离心，去除上清，向细胞沉淀加入细胞培养液，重悬至3-15ml作为原代细胞，后转移至培养皿培养，得到P

【技术特征摘要】
1.自体皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：
S1：切取一块人自体脸颊或耳后皮肤组织，将组织在无菌环境下完全浸泡于组织处理液中10-20min，将浸泡后的组织去除脂肪组织及结缔组织，剩余组织置于无菌培养皿中剪碎；
S2：将剪碎后的组织加入37℃预热的含Hank’s平衡盐溶液的混合酶消化液进行消化，消化结束后加入终止消化液以终止消化；
S3：将所得组织液合并至离心管中，离心，去除上清，向细胞沉淀加入细胞培养液，重悬至3-15ml作为原代细胞，后转移至培养皿培养，得到P0成纤维细胞；
S4：将P0代细胞接种至培养瓶中，培养结束后收集细胞，得到P1代成纤维细胞，取样并计数细胞的数量和活率。


2.根据权利要求1所述的自体皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述S1中组织处理液为含有0.8-1.2％双抗的0.9％生理盐水。


3.根据权利要求1所述的自体皮肤成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述S1中剪碎后组织的大小为0.1-0.3mm3。...

【专利技术属性】
技术研发人员：李怡林，
申请(专利权)人：纳美细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32