高效三维培养血管内皮细胞的方法技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体涉及一种高效三维培养血管内皮细胞的方法。针对现有贴壁生长细胞3D微组织培养的耗材贵，形成微组织球体时间较长、效率低等问题，本发明专利技术提供了一种高效三维培养血管内皮细胞的方法，包括以下步骤：a,配制甲基纤维素培养基；b,接种内皮细胞到低粘附平面形成悬滴；c,18‑24小时后收集内皮细胞微组织球体；d，内皮细胞微组织球体进行出芽实验检测其血管新生能力。本方法所使用的甲基纤维素培养基和低粘附平面均采用实验室常用试剂耗材制备，无需专门购买，可得性强，成本较低，且微组织球体形成时间明显缩短，提高实验效率，适于后续内皮细胞微组织球体功能检测及药物筛选。

【技术实现步骤摘要】
高效三维培养血管内皮细胞的方法
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种高效三维培养血管内皮细胞的方法。
技术介绍
血管内皮细胞在标准二维培养体系中会丢失许多分化完成后的表型特征，这对在体外培养条件下研究分化完成后的内皮细胞功能产生了限制。三维细胞培养体系为内皮细胞提供了更加接近体内生存条件的微环境，能够更好的模拟生理状态，从而能够获得与体内实验更加一致的实验结果。目前三维细胞培养技术中应用最广阔的是无支架培养体系，其可通过悬滴让细胞在重力的作用下通过自组装形成微球体。该体系形成的微组织球体具有高一致性，可为后续研究提供好的微组织材料。专利CN108060132A公开了一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3D共培养模型，该方法采用的3D培养基成分为含有0.24％的甲基纤维素的细胞培养基，然后将含有2500个细胞的100μl3D细胞培养基加入未经过组织处理的96孔圆底板，3天后形成微组织球体。该方法仍需专门购买商业化的未经过组织处理的圆底培养板，且细胞接种到上述培养装置后形成微组织球体时间较长(3天)，影响实验效率。另外，由于该培养装置的培养孔数目固定，通常为96孔，如果实验中仅需使用少量微组织球体，容易造成浪费。专利CN111334469A和CN111334470A公开了一种外周血单个核细胞体外3D甲基纤维素琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法，该方法需要配制数种不同浓度甲基纤维素和琼脂糖溶液，且由于琼脂糖溶液在最终形成水凝胶之前均需控制温度以避免凝固，否则将无法进行后续操作，操作过程繁琐。且该方法本身用于非贴壁细胞的培养，未能提供其在贴壁细胞三维培养中的微组织球体形成所需时间及效果。因此，该方法无法为贴壁细胞三维培养形成微组织球体提供启示。目前，仅有商业化的悬滴板可以用来进行细胞的3D微组织培养，该商业化的悬滴板必须要经过特别的处理，才能避免细胞贴壁生长，从而形成微球体。但是，商业化的悬滴板购买不易，仅有少数几家国外的耗材公司提供，价格昂贵，且培养孔数目固定，不易根据所需微组织数量调整耗材用量，灵活性较低。因此，如何采用普通的实验装置实现血管内皮细胞的无支架培养成为了行业内亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：现有贴壁生长细胞3D微组织培养的耗材贵，形成微组织球体时间较长、效率低等问题。本专利技术解决上述技术问题的技术方案为：提供一种高效三维培养血管内皮细胞的方法。该方法包括以下步骤：a、配制含有浓度为0.5％～2％的甲基纤维素的DMEM培养基；b、将62500～375000个血管内皮细胞重悬在终体积为4ml含20％FBS的高糖DMEM完全培养基中，加入1ml步骤a的培养基，混合均匀，制备得到单细胞悬液；c、取40μl步骤b的单细胞悬液，接种至低粘附平面，将平面翻转后，形成悬滴，将悬滴在温度37℃、CO2浓度5％的条件下进行培养，得到血管内皮细胞的微组织球体。其中，上述高效三维培养血管内皮细胞的方法中，步骤a中所述的甲基纤维素粘稠度为4000cp。进一步的，上述高效三维培养血管内皮细胞的方法中，步骤a中所述的甲基纤维素浓度为1.2％。进一步的，上述高效三维培养血管内皮细胞的方法中，步骤a中所述的甲基纤维素购自Sigma-Aldrich公司，货号为M0512。进一步的，上述高效三维培养血管内皮细胞的方法中，步骤a所述培养基的具体配制方法为：称取2.5～10g甲基纤维素，转移至已经加入磁力搅拌子的500ml广口瓶中，高温高压灭菌；加热250mlDMEM基础培养基到60℃，将培养基加入灭菌完毕的甲基纤维素中，室温下磁力搅拌20min；室温下加入250mlDMEM基础培养基，然后在4℃下磁力搅拌过夜；室温下5,000g离心2小时，上清备用。其中，上述高效三维培养血管内皮细胞的方法中，步骤b中的细胞浓度取决于所需微组织球体大小，内皮细胞数量可从500/球体到3000/球体，根据实际所需球体大小决定细胞数量。其中，上述高效三维培养血管内皮细胞的方法中，步骤c所述的低粘附平面为普通无菌培养皿皿盖。其中，上述高效三维培养血管内皮细胞的方法中，为防止悬滴干涸，可在下面培养皿中加入少量PBS，形成湿盒。悬滴培养内皮细胞形成微组织球体后，可翻转皿盖在显微镜下观察球体，换液，转染，荧光标记等操作。本专利技术在培养时发现，悬滴中的内皮细胞从培养后4小时开始聚集，18小时到24小时即可形成微组织球体。收集内皮细胞微组织球体进行出芽实验：使用移液枪将微组织球体转移入基质胶包被的普通96孔板中(1个球体/孔)，培养24h后在倒置显微镜下观察内皮细胞出芽式血管新生能力；或者使用5ml血清吸管吸取10ml磷酸盐缓冲液PBS冲洗悬滴，收集PBS冲洗液，转移至15ml离心管。200g转速离心5分钟。丢弃上清后加入6ml甲基纤维素-胶原蛋白培养基重悬微组织球体。甲基纤维素-胶原蛋白培养基配方：20％(v/v)FBS，0.5％(w/v)甲基纤维素,1.5mg/ml鼠尾I型胶原以及补足的DMEM培养基。然后接种到24孔板中进行培养(1ml/孔)。24小时后在倒置显微镜下观察内皮细胞出芽式血管新生能力。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种实验室高效三维培养血管内皮细胞的方法，采用实验室常规耗材试剂对血管内皮细胞进行3D培养，利用悬滴法组装微组织球体。本专利技术可在不采用昂贵培养器皿的前提下，仅采用现有常规的培养器皿进行血管内皮细胞的3D培养，能显著的降低试验成本。并且，采用本专利技术的培养方法，18～24小时即可形成微组织球体，相比现有方法的3天，显著的提高了实验效率。另外，可根据实验需要微组织球体数目，灵活控制所需实验耗材，避免试剂耗材浪费，比如本方法可以根据所需球体数目灵活选择35mm，60mm，100mm和150mm培养皿。本专利技术的培养方法更高效、低廉且实用，具有很高的价值。附图说明图1所示为本专利技术实施例1和实施例2培养体系所需的常规耗材器皿。图2所示为本专利技术实施例1和实施例2培养体系对内皮细胞进行三维培养时形成的悬滴。图3所示为本专利技术实施例1和实施例2培养体系形成的内皮细胞悬滴在显微镜下进行直接观察。图4为本专利技术实施例1和实施例2内皮细胞聚集而成的微组织球体在显微镜下的形态(bar＝100μm)。图5所示为本专利技术实施例1对内皮细胞微组织球体在基质胶表面进行出芽实验检测(bar＝100μm)。图6所示为本专利技术实施例2对内皮细胞微组织球体在胶原蛋白-甲基纤维素培养基中进行出芽式血管新生能力的检测(bar＝200μm)。具体实施方式本专利技术提供了一种高效三维培养血管内皮细胞的方法，包括以下步骤：a、配制含有浓度为0.5％～2％的甲基纤维素的DMEM培养基；b、将62500～375000个血管内皮细胞重悬在终体积为4ml含20％FBS的高糖DMEM完全培养基中，加入1ml步骤a的培养基，混合均匀，制备得到单细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高效三维培养血管内皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：/na、配制含有浓度为0.5％～2％的甲基纤维素的DMEM培养基；/nb、将62500～375000个血管内皮细胞重悬在终体积为4ml含20％FBS的高糖DMEM完全培养基中，加入1ml步骤a的培养基，混合均匀，制备得到单细胞悬液；/nc、取40μl步骤b的单细胞悬液，接种至低粘附平面，将平面翻转后，形成悬滴，将悬滴在温度37℃、CO

【技术特征摘要】
1.高效三维培养血管内皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、配制含有浓度为0.5％～2％的甲基纤维素的DMEM培养基；
b、将62500～375000个血管内皮细胞重悬在终体积为4ml含20％FBS的高糖DMEM完全培养基中，加入1ml步骤a的培养基，混合均匀，制备得到单细胞悬液；
c、取40μl步骤b的单细胞悬液，接种至低粘附平面，将平面翻转后，形成悬滴，将悬滴在温度37℃、CO2浓度5％的条件下进行培养，得到血管内皮细胞的微组织球体。


2.根据权利要求1所述的高效三维培养血管内皮细胞的方法，其特征在于：步骤a中所述的甲基纤维素粘稠度为4000cp。


3.根据权利要求1所述的高效三维培养血管内皮细胞的方法，其特征在于：步骤a中所述的甲基纤维素浓度为1.2％。


4.根据权利要求1所述的高效三维培养血管内皮细胞的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51