博卡病毒小肠上皮类器官感染模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种博卡病毒小肠上皮类器官感染模型的构建方法，其中，该方法包括：小肠上皮类器官的分离与培养；博卡病毒感染小肠上皮类器官。该模型的解决了博卡病毒尚无体外分离培养的方法的问题，尤其是消化道感染模型，同时用于快速评估博卡病毒的传染性，以及为博卡病毒感染肠道的致病机理提供了新的实验基础。

【技术实现步骤摘要】
博卡病毒小肠上皮类器官感染模型的构建方法
本专利技术涉及生物
，具体的涉及博卡病毒小肠上皮类器官感染模型的构建方法。
技术介绍
人博卡病毒(humanbocavirus,HBoV)是瑞典学者TobiasAllander等通过分子筛选发现的一种新的细小病毒，其氨基酸序列与犬细小病毒(canineminutevirus,CMV)氨基酸序列的同源性为43％，与牛博卡病毒(bovineparvovirus,BPV)氨基酸序列的同源性为42％。属于细小病毒科，博卡病毒属，为正二十面体的无包膜单链线性DNA病毒，基因组全长5.2kb，含3个开放读码框，分别编码非结构蛋白NS1、NP1和结构蛋白VP1/VP2，HBoV的基因组保守性相对较好，VP1/VP2基因的多样性相对较多。人博卡病毒作为一种新发现的病原体，是对ARTIs的病毒性病原谱的重要补充。由于其在上呼吸道感染中占有一定的比例，特别是能引起严重的下呼吸道感染，引起各国科学家和临床工作者的高度重视，对该病原体的研究也逐步深入。自2005年被发现以后，世界范围内均有在呼吸道、血清、粪便及尿液标本中检测出HBoVsDNA的报道。由于HBoVsDNA序列相对保守，其检测主要是通过PCR方法扩增其DNA片段进行，但普通PCR方法费时费力，出于检测目的迫切需要，采用高灵敏度和特异度的实时荧光定量PCR(RealtimePCR)，可以大大提高HBoV的检出速度，实现病毒DNA的定量。目前，研究报道呼吸道感染患者的呼吸道标本中HBoV的阳性检出率为0.8％～19％，胃肠道疾病患者粪便或尿标本中的检出率为0.8％～9.1％。HBoVs男性感染率高于女性，为1.5-2.5:1。HBoVsDNA阳性患者年龄分布从几天到60岁不等，年龄6个月至2岁的儿童阳性率最高，而6个月以下的婴幼儿感染率相对较低。目前，在成人患者中较少研究HBoVs，且成人标本中HBoVsDNA检出率较低为0％-1.5％。与呼吸道合胞病毒相似，HBoVs感染无明显的季节性，但目前的报道以冬季为主。HBoVs阳性的呼吸道和胃肠道标本中常有其它病原体的共同检出，中位混合感染率为42.5％，常见混合感染病原体包括鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和轮状病毒等。最近新的HBoV病毒被相继报道，分别命名为人类博卡病毒2(HBoV2)、人类博卡病毒3(HBoV3)和人类博卡病毒4(HBoV4)；目前为止尚未确定4种人博卡病毒是各代表不同的病毒体，还是单一病毒的不同基因型。为清楚地将Allander等最初发现的人博卡病毒与新发现的HBoV2-4区分，有报道称其为HBoV1。目前为止，HBoV1和HBoV2在呼吸道及肠道标本中均有检出，HBoV3和HBoV4是最新被发现的博卡种属，HBoV4仅在肠道标本中被检出。HBoV1DNA最初在下呼吸道感染患儿的呼吸道标本中检出，且检出率高于其他病毒，被认为是下呼道感染的新病原。现已报道与其相关的呼吸道疾病有肺炎、支气管炎、鼻炎、咽喉炎和哮喘等，我国各地陆续有呼吸道和胃肠道博卡病毒感染的报道，呼吸道以HBoV1为主，胃肠道以HBoV2报道多见，近年报道以HBoV1为主的胃肠道感染地区也渐趋多见，HBoV1-4均有检出报道。各地腹泻病例博卡病毒检出率差异较大，报道最高的达25.77％，因此，博卡病毒极可能成为继轮状病毒，肠腺病毒，人杯状病毒后主要的致腹泻病毒之一。一些研究报道HBoV1与重症肺疾病及儿童喘息密切相关，携带HBoV1的哮喘患儿50％以上为单一HBoV1感染，而混合感染儿童则较少诊断为哮喘。目前为此，尚无与HBoVs有关的死亡病例的报道。由于HBoVs常与其它病原体共同检出，而目前尚无有效的体外培养体系和敏感的动物模型，故难以确定其在呼吸道疾病中的传染性和致病性。研究者曾认为不同地区流行的HBoV病毒株核苷酸序列高度保守，但HBoV2–4的发现表明其核苷酸序列也有较高的多样性。HBoV3的非结构蛋白(NS1和NP1)编码区与HBoV1的有87％的氨基酸同源性，结构蛋白编码区与HBoV2的更相似，氨基酸同源性为77％，被认为可能是由HBoV1和HBoV2重组来自的重组株。同样，HBoV4被认为是由HBoV2的非结构蛋白编码区和HBoV3结构蛋白编码区重组产生。近来，Fu等报道HBoVs存在HBoV1和HBoV4的型间重组以及HBoV2型内重组。研究发现HBoVs间存在合并感染现象，进一步支持了其发生重组的可能。HBoVs重组可导致病毒毒力及抗原性的变异，有可能引起广泛流行，因此HBoVs重组研究对于HBoVs的流行病学调查和疾病防控有着重要意义。目前建立博卡病毒感染模型，是研究博卡病毒在人体中的传染性和机制的关键。在我国北京、兰州和浙江等地均有关于HBoV的报道，HBoV1-2在中国患者的呼吸道及粪便标本中均有检出，HBoV3在粪便标本中检出，但近期兰州的研究报道在呼吸道标本中检出HBoV3，但国内尚未有检出HBoV4的报道。研究结果显示中国呼吸道标本中检出的HBoVs主要为HBoV1，而粪便标本以HBoV2为主。在我国HBoV的阳性检出率相差较大且常与其它病原体共检出，呼吸道标本和粪便标本中的阳性检出率分别为1.4％-19.3％和2.1％-25.6％，混合感染率分别为9.5％-55.2％和56％-100％(最常见的混合感染病原体分别是RSV和轮状病毒)。目前研究结果显示，HBoV感染以3岁以下儿童为主，无明显的季节性分布，患者的呼吸道及胃肠道疾病症状各不相同。目前国内较少在成人患者中研究HBoV，且所报道的成人的检出率较低。因此，HBoV与我国成人呼吸道疾病的关系仍有待进一步的研究。目前还没有一种健全的体外模型来评估博卡病毒在人体中的传染性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种博卡病毒小肠上皮类器官感染模型的构建方法。无论在呼吸道还是消化道核酸检测阳性的临床样本，我们用可长期扩增的小肠上皮类器官建立博卡病毒感染模型，分化条件接近生理水平，形态和功能上模拟人肠道上皮的小肠上皮类器官，建立的小肠上皮类器官可用于快速评估新型肠道病毒对人体的传染性。具体的，本专利技术提供了一种博卡病毒小肠上皮类器官感染模型的构建方法，其中，该方法包括：小肠上皮类器官的分离与培养；博卡病毒感染小肠上皮类器官。在一些实施例中，小肠上皮类器官的分离与培养包括：(1)正常肠组织，剥离肌层，将粘膜上皮组织切成小的组织块，用冰冷的PBS洗涤；(2)组织块用Liberase酶消化，消化期间用枪头剧烈吹打；(3)消化剩下的碎片再用胰蛋白酶或胰蛋白酶替代酶处理；(4)收集上清，低温下离心；细胞团块用基底膜基质重悬，分散至培养板中；(5)所述基底膜基质在37℃条件下聚合10-15min，并每孔加入人肠道类器官培养基覆盖培养。在一些实施例中，小肠上皮类器官的分离与培养包括：(1)洗涤正常肠组织，用无菌手术刀片剥离肌层，将粘膜上皮组织切成约5mm大小的小块，用冰冷的PBS洗涤10次；(2)组织块用Liberase酶于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种博卡病毒小肠上皮类器官感染模型的构建方法，其中，该方法包括：小肠上皮类器官的分离与培养；博卡病毒感染小肠上皮类器官。/n

【技术特征摘要】
1.一种博卡病毒小肠上皮类器官感染模型的构建方法，其中，该方法包括：小肠上皮类器官的分离与培养；博卡病毒感染小肠上皮类器官。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，小肠上皮类器官的分离与培养包括：
(1)正常肠组织，剥离肌层，将粘膜上皮组织切成小的组织块，用冰冷的PBS洗涤；
(2)组织块用Liberase酶消化，消化期间用枪头剧烈吹打；
(3)消化剩下的碎片再用胰蛋白酶或胰蛋白酶替代酶处理；
(4)收集上清，低温下离心；细胞团块用基底膜基质重悬，分散至培养板中；
(5)所述基底膜基质在37℃条件下聚合10-15min，并每孔加入人肠道类器官培养基覆盖培养。


3.根据权利要求1所述的构建方法，其中，小肠上皮类器官的分离与培养包括：
(1)洗涤正常肠组织，用无菌手术刀片剥离肌层，将粘膜上皮组织切成约5mm大小的小块，用冰冷的PBS洗涤10次；
(2)组织块用Liberase酶于37℃消化60min，每隔15min用枪头剧烈吹打一次；
(3)消化剩下的碎片再使用胰酶TrypLEExpress于37℃消化处理20min；
(4)收集上清，4℃下，200g离心3min；细胞团块用Matrigel重悬，并分散到2块48孔培养板中；
(5)Matrigel在37℃条件下聚合10min，并每孔加入500μl的人肠道类器官培养基覆盖培养。


4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其中，步骤(5)后还包括：每2天更换一次人肠道类器官培养基，培养基用新鲜的底层培养基替换，类器官和Matrigel用移液枪枪头打碎，转移到离心管中，并进一步机械解离，解离的类器官用底层培养基洗涤，离心，去上清，团块用Matrigel重悬，再加入培养基。


5.根据权利要求1所述的构建方法，其中，博卡病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈喆，叶智浩，
申请(专利权)人：保信亚太生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44