一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法技术

本发明专利技术属于细胞生物学检测技术领域，公开了一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，包括：制备葡萄籽提取物，加水稀释获得花青素溶液；将建模小鼠进行高脂饲料饲养28天；令小鼠空腹6小时后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖浓度；对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食28天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，使用组织固定剂进行固定；用石蜡包埋，作冠状切片；使用试剂盒进行胰岛β细胞凋亡情况的观察。本发明专利技术使用葡萄籽提取物作为花青素来源进行小鼠胰岛β细胞自噬效果检测，检测效果更好；糖尿病小鼠建模能够实现对糖尿病病体组织的获取，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒仅需进行切片的洗涤和染色，检测效果展现更直观。

【技术实现步骤摘要】
一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法
本专利技术属于细胞生物学检测
，尤其涉及一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法。
技术介绍
目前，自噬是细胞利用溶酶体降解已受损的大分子物质和细胞器的过程，自噬连续不断清理错误折叠的蛋白质、有害的代谢产物、老化的线粒体等细胞器，从而保持胰岛β细胞的正常状态。研究表明，花青素具有很强的自由基清除和抗氧化活性能力，在预防心血管疾病、肿瘤、糖尿病中发挥着重要的作用。桑树果实花色苷提取物素通过抗氧化应激抑制胰岛β细胞凋亡，从而预防糖尿病。但是目前暂无检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，无法为糖尿病防治提供理论依据。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前暂无检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，无法为糖尿病防治提供理论依据。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法。本专利技术是这样实现的，一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：步骤一，称取原料葡萄籽，将葡萄籽洗净后进行干燥；将干燥的葡萄籽粉碎，过80～120目筛，得到葡萄籽粉末。步骤二，向葡萄籽粉末中加入粉末质量体积5～9倍量、温度为100～110℃的热水搅拌20～25min，过滤，得滤液A。步骤三，将滤液A过大孔树脂DM21吸附，并用水洗杂，得滤液B；所述大孔树脂的加入量为所述滤液量的1.0～1.3倍。<br>步骤四，向滤液B中加入浓度为60％的乙醇，超声提取得到葡萄籽提取液；将葡萄籽提取液进行真空干燥，得到葡萄籽提取物。步骤五，将葡萄籽提取物直接过LSK11树脂，收集流出液；将流出液用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物20～30min，得到纯化的葡萄籽提取物。步骤六，将纯化的葡萄籽提取物减压浓缩为婆美度为15～20的浓缩液，并进行喷雾，得产品葡萄籽提取物；加水稀释获得花青素溶液，作为检测试剂。步骤七，将建模小鼠进行高脂饲料饲养，饲养时间为28～30天；令小鼠空腹6～8h后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖，血糖浓度高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型。步骤八，对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食，喂食时间为28～30天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，分离获得小鼠胰岛β细胞。步骤九，将获得的小鼠胰岛β细胞接种于培养瓶中，预培养3～5天，得预培养体系；将所述预培养体系无菌注入材质为FEP的细胞培养袋中。步骤十，将含10％胎牛血清的RPMI1640培养液的细胞培养基注入培养基保存袋中；利用联通管将所述细胞培养袋和培养基保存袋进行连接，所述联通管上设置有可拆卸的三通止流阀。步骤十一，将所述细胞培养袋置于培养箱中进行培养，所述培养箱内设置温度为37℃，CO2浓度为5％；将所述培养基保存袋置于4℃冰箱内培养小鼠胰岛β细胞，利用流式细胞技术构建小鼠胰岛β细胞凋亡模型。步骤十二，将培养后的小鼠胰岛β细胞使用组织固定剂进行固定；用石蜡包埋，作冠状切片。步骤十三，使用碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒作为检测用试剂盒，并将已固定的冠状切片使用二甲苯进行2次脱蜡。步骤十四，依次用100％、95％、75％乙醇进行水化，水化共进行三次，每次1min；使用PBS缓冲液进行二次洗涤，后进行染色，并室温孵育10min；使用PBS缓冲液进行三次洗涤，观察试剂盒胰岛β细胞凋亡情况的显示结果。进一步，步骤四中，所述超声提取中的超声频率为35～45Hz，超声时间为30～40min，超声提取温度为40～50℃。进一步，步骤五中，所述用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物时，低温等离子体气氛为体积比为1～2:1的O2和N2。进一步，步骤六中，所述减压浓缩的条件为-0.05～-0.1MPa，40～65℃；所述喷雾时的进口温度为180～200℃，出口温度为85～95℃。进一步，步骤七中，所述建模小鼠为3～5月龄的雄性SD小鼠，体重为200～240克。进一步，步骤七中，所述高脂饲料按照质量份数由麸皮10～15份、玉米10～12份、豆粕8～15份、酪蛋白6～8份、麦芽糊精10～12份、大豆油3～6份、胆固醇1～2份组成。进一步，步骤八中，所述对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食时，花青素溶液摄入量为每天10ml。进一步，步骤九中，所述无菌注入的方法包括：在无菌操作台上，取一个50mL注射器，去掉推塞后，悬挂于支架上，同时利用软管将注射器的套筒与细胞培养袋的进样口连接，然后注入所述预培养体系。进一步，步骤十二中，所述组织固定剂为植物单宁与缓冲溶液的混合液，所述植物单宁与缓冲溶液的混合液的体积比为1:40。进一步，所述缓冲溶液为氢氧化钠、柠檬酸、尿素、磷酸与去离子水的混合溶液。结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：本专利技术使用葡萄籽提取物作为花青素来源进行小鼠胰岛β细胞自噬效果检测，花青素含量高，检测效果更好；糖尿病小鼠建模能够实现对糖尿病病体组织的获取，方便实现检测；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒仅需进行切片的洗涤和染色，即可实现显色，检测效果展现更直观。利用本专利技术所述方法进行小鼠胰岛β细胞的培养，培养过程从预培养后就封闭式培养，可以规避避免细菌污染；完全培养基在4℃保存，因子效价稳定，避免了营养物质37℃降解，每天的检测更加方便快捷，成本低。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例提供的检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法的流程图。图2是本专利技术实施例提供的制备葡萄籽提取物的流程图。图3是本专利技术实施例提供的使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行胰岛β细胞凋亡情况的观察的流程图。图4～图5是本专利技术实施例提供的使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行胰岛β细胞凋亡情况的检测结果图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，下面结合附图对本专利技术作详细的描述。如图1所示，本专利技术实施例提供的检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：S101，制备葡萄籽提取物，加水稀释获得花青素溶液，作为检测试剂；将建模小鼠进行高脂饲料饲养，饲养时间为28～30天。S102，令小鼠空腹6～8h后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖，血糖浓度高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型。...

【技术保护点】
1.一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：/n步骤一，称取原料葡萄籽，将葡萄籽洗净后进行干燥；将干燥的葡萄籽粉碎，过80～120目筛，得到葡萄籽粉末；/n步骤二，向葡萄籽粉末中加入粉末质量体积5～9倍量、温度为100～110℃的热水搅拌20～25min，过滤，得滤液A；/n步骤三，将滤液A过大孔树脂DM21吸附，并用水洗杂，得滤液B；所述大孔树脂的加入量为所述滤液量的1.0～1.3倍；/n步骤四，向滤液B中加入浓度为60％的乙醇，超声提取得到葡萄籽提取液；将葡萄籽提取液进行真空干燥，得到葡萄籽提取物；/n步骤五，将葡萄籽提取物直接过LSK11树脂，收集流出液；将流出液用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物20～30min，得到纯化的葡萄籽提取物；/n步骤六，将纯化的葡萄籽提取物减压浓缩为婆美度为15～20的浓缩液，并进行喷雾，得产品葡萄籽提取物；加水稀释获得花青素溶液，作为检测试剂；/n步骤七，将建模小鼠进行高脂饲料饲养，饲养时间为28～30天；令小鼠空腹6～8h后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖，血糖浓度高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型；/n步骤八，对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食，喂食时间为28～30天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，分离获得小鼠胰岛β细胞；/n步骤九，将获得的小鼠胰岛β细胞接种于培养瓶中，预培养3～5天，得预培养体系；将所述预培养体系无菌注入材质为FEP的细胞培养袋中；/n步骤十，将含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液的细胞培养基注入培养基保存袋中；利用联通管将所述细胞培养袋和培养基保存袋进行连接，所述联通管上设置有可拆卸的三通止流阀；/n步骤十一，将所述细胞培养袋置于培养箱中进行培养，所述培养箱内设置温度为37℃，CO...

【技术特征摘要】
1.一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：
步骤一，称取原料葡萄籽，将葡萄籽洗净后进行干燥；将干燥的葡萄籽粉碎，过80～120目筛，得到葡萄籽粉末；
步骤二，向葡萄籽粉末中加入粉末质量体积5～9倍量、温度为100～110℃的热水搅拌20～25min，过滤，得滤液A；
步骤三，将滤液A过大孔树脂DM21吸附，并用水洗杂，得滤液B；所述大孔树脂的加入量为所述滤液量的1.0～1.3倍；
步骤四，向滤液B中加入浓度为60％的乙醇，超声提取得到葡萄籽提取液；将葡萄籽提取液进行真空干燥，得到葡萄籽提取物；
步骤五，将葡萄籽提取物直接过LSK11树脂，收集流出液；将流出液用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物20～30min，得到纯化的葡萄籽提取物；
步骤六，将纯化的葡萄籽提取物减压浓缩为婆美度为15～20的浓缩液，并进行喷雾，得产品葡萄籽提取物；加水稀释获得花青素溶液，作为检测试剂；
步骤七，将建模小鼠进行高脂饲料饲养，饲养时间为28～30天；令小鼠空腹6～8h后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖，血糖浓度高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型；
步骤八，对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食，喂食时间为28～30天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，分离获得小鼠胰岛β细胞；
步骤九，将获得的小鼠胰岛β细胞接种于培养瓶中，预培养3～5天，得预培养体系；将所述预培养体系无菌注入材质为FEP的细胞培养袋中；
步骤十，将含10％胎牛血清的RPMI1640培养液的细胞培养基注入培养基保存袋中；利用联通管将所述细胞培养袋和培养基保存袋进行连接，所述联通管上设置有可拆卸的三通止流阀；
步骤十一，将所述细胞培养袋置于培养箱中进行培养，所述培养箱内设置温度为37℃，CO2浓度为5％；将所述培养基保存袋置于4℃冰箱内培养小鼠胰岛β细胞，利用流式细胞技术构建小鼠胰岛β细胞凋亡模型；
步骤十二，将培养后的小鼠胰岛β细胞使用组织固定剂进行固定；用石蜡包埋，作冠状切片；
步骤十三，使用碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒作为检测用试剂盒，并将已固定的冠状切片使用二甲苯进行2次脱蜡；
步骤十四，依次用100％、95％、75％乙醇进行水化，水化共进行三次，每次1min；使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁源，刘新光，郑慧玲，崔红晶，蒋智文，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44