甜瓜抗霜霉病InDel标记物及其应用制造技术

本发明专利技术具体提供甜瓜抗霜霉病InDel标记，采用InDel 15和InDel20作为分子标记，本发明专利技术获得的分子标记及其特异性引物，可以在早期对抗霜霉病品种进行筛选鉴定，鉴定结果准确率高，测定结果可靠，可以大大缩短育种周期，提高育种效率，具有重要的理论及实践意义。并且提供的用于筛选具有甜瓜霜霉病抗性的甜瓜质资源的试剂盒，通过对PCR扩增产物直接电泳检测，可以清晰地将区分甜瓜材料是否为抗霜霉病品种，省时省力，不受环境影响。

【技术实现步骤摘要】
甜瓜抗霜霉病InDel标记物及其应用
本专利技术属于分子遗传育种领域，具体涉及与甜瓜抗霜霉病分子标记物及其应用的

技术介绍
甜瓜(CucumismeloL.)是葫芦科甜瓜属一年生的重要园艺经济作物，果实甘甜，芳香浓郁，深受消费者喜爱，畅销世界各国。甜瓜霜霉病是由古巴霜霉菌(Pseudoperonosporacubensis(Berk.etCurt.)Rostov.)引起的真菌性病害。在高温高湿条件下，该病害扩展迅速，严重影响甜瓜的产量和品质，是一种毁灭性、世界性病害。化学防治霜霉病不仅增加种植成本、污染环境，而且还会导致病原菌产生抗药性，因此培育抗病品种是防治甜瓜霜霉病的降本增效且环境友好的根本途径。利用常规育种的方法选育抗病材料是根据植株的表型抗感特征进行筛选，是以选育者的主观判断为标准，具有很大的不稳定性，且有时会因为接种不充分或发病条件不适宜而影响选择效率，难以准确、快速地筛选出具有抗病基因的单株。通过挖掘与抗病性的分子标记物并应用于辅助筛选育种将表型选择转变为基因型选择，在苗期对杂交后代进行筛选，可以显著提高筛选效率，加快育种进程。
技术实现思路
为克服传统方法在选育抗病材料中费时、费力、易受环境影响等缺点，现有技术未见披露甜瓜抗霜霉病InDel分子标记物。本专利技术提供了与甜瓜抗霜霉病InDel(insertion-deletio，插入缺失标记)分子标记物及应用，可以用于抗霜霉病辅助筛选育种，显著加快新品种选育的速度与精度。本专利技术公开了与甜瓜抗霜霉病InDel分子标记物，所述InDel分子标记物为InDel15和InDel20。所述Indel15标记物的引物的核苷酸序列如下：InDel15F/InDel15R:5’-TCACAGCTCACAATCACAGGT-3’/5’-AGGGGAAGCTGGAGAAGACA-3’所述引物扩增的与甜瓜抗霜霉病Indel15标记特征条带为251bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示。所述引物扩增的与甜瓜抗霜霉病的Indel15标记特征条带为231bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.4所示。所述Indel20标记的引物的核苷酸序列如下：InDel20F/InDel20R:5’-TGGGGTTGCTTGTGGATAGT-3’/5’-AGGCGAACACCTTTTGATTCA-3’所述引物扩增的与甜瓜抗霜霉病的Indel20标记特征条带为349bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.7所示；所述引物扩增的与甜瓜抗霜霉病的Indel20标记特征条带为324bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.8所示。进一步的，本专利技术提供用于筛选具有甜瓜霜霉病抗性的甜瓜质资源的试剂盒，其中包括Indel标记的引物；所述Indel标记的引物的核苷酸序列如下：所述引物扩增的与甜瓜抗霜霉病的Indel标记特征条带为251bp或231bp或349bp或324bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3、SeqIDNo.4、SeqIDNo.7、SeqIDNo.8所示。所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂。更进一步的，本专利技术还提供用于筛选具有甜瓜霜霉病抗性的甜瓜种质资源的方法，采用分子标记物为InDel15和InDel20或上述的试剂盒进行如下步骤：(1)利用CTAB法提取甜瓜待测样品任意组织或器官的基因组DNA；(2)以步骤(1)所得的待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记专用引物对不同材料进行PCR扩增，获得扩增产物；(3)对步骤(2)所得的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；(4)利用银染法检测凝胶电泳的结果，观察PCR扩增产物的大小；(5)通过判断片段大小鉴定，扩增的PCR产物片段较大的为抗霜霉病的甜瓜材料，扩增片段较小的为感霜霉病菌的甜瓜材料。优选的，其中所述PCR扩增的反应体系为：2XPCRSuperMix10μL，cDNA模板2.0μL，Indel标记上、下游引物(10μM)各0.5μL、ddH2O7.0μL，总体系为20μL。优选的，其中所述PCR扩增的反应程序为：95℃，预变性3min；95℃变性30s；退火温度InDel15：57℃/InDel20：55℃进行30s；72℃延伸30s；28个循环后72℃终延伸10min优选的，其中所述凝胶电泳检测指，采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于120V/500mA恒功率电泳90min分离，最后银染显色。同时，更进一步的本专利技术还提供一种用于筛选甜瓜抗霜霉病的甜瓜种质资源的试剂盒的制备方法，组装试剂盒的试剂中包括与甜瓜抗霜霉病的InDel分子标记物InDel15和InDel20扩增引物。同时，组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂。本专利技术中，采用的抗霜霉病甜瓜种质及感病新疆甜瓜地方品种“黄凸”均为市场购买获得，普通技术人员可以通过公众渠道获得，上述两种甜瓜种质资源的培养条件都可采用本领域常见报道获得。通过实施本专利技术具体的
技术实现思路
，可以达到以下有益效果：(1)本专利技术首次获得与甜瓜抗霜霉病InDel分子标记物：InDel15和InDel20。(2)本专利技术获得的分子标记及其特异性引物，可以在早期对抗霜霉病品种进行筛选鉴定，鉴定结果准确率高，测定结果可靠，可以显著缩短育种周期，显著提高育种效率，具有重要的理论及实践意义。(3)通过对PCR扩增产物直接电泳检测，可以清晰地将区分甜瓜材料是否为抗霜霉病品种，省时省力，不受环境影响。附图说明图1显示为InDel15引物扩增结果图。其中1：抗霜霉病亲本K7-6，12：感霜霉病亲本黄凸，1～5：抗病单株，6～10：感病单株，M：2KDNAMarker。图2显示为InDel20引物扩增结果图。其中1：感霜霉病亲本黄凸，2：抗霜霉病亲本K7-6，3～7：抗病单株，8～12：感病单株，M：2KDNAMarker。具体实施方式下面，举实施例说明本专利技术，但是，本专利技术并不限于下述的实施例。本专利技术中材料有：液氮、蒸馏水、双蒸水、氯仿：异戊醇(24:1)、无水乙醇、琼脂糖、2XPCRSuperMix、丙烯酰胺母液、5×TBE、AP、TEMED。本专利技术中所用仪器有及材料：离心管、钢珠、液氮罐、离心机、恒温水浴锅、涡旋震荡仪、超微量分光光度计、微博里、电泳槽、电泳仪、PCR仪、摇床。上述所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。本专利技术中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本专利技术的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本专利技术以下实施方式的实施。以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甜瓜抗霜霉病Indel标记物，其特征在于：含有Indel 15标记物，所述Indel标记物的引物的核苷酸序列如SeqID No.1和SeqID No.2所示；/n所述引物扩增的甜瓜抗霜霉病标记物Indel 15标记特征条带为251bp，其核苷酸序列如SeqID No.3所示；/n所述引物扩增的甜瓜抗霜霉病标记物Indel 15标记特征条带为231bp，其核苷酸序列如SeqID No.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种甜瓜抗霜霉病Indel标记物，其特征在于：含有Indel15标记物，所述Indel标记物的引物的核苷酸序列如SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示；
所述引物扩增的甜瓜抗霜霉病标记物Indel15标记特征条带为251bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示；
所述引物扩增的甜瓜抗霜霉病标记物Indel15标记特征条带为231bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.4所示。


2.一种甜瓜抗霜霉病Indel标记物，其特征在于：含有Indel20标记物，所述Indel标记物的引物的核苷酸序列如SeqIDNo.3和SeqIDNo.4所示；
所述引物扩增的甜瓜抗霜霉病标记物Indel20标记特征条带为349bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.7所示；
所述引物扩增的甜瓜抗霜霉病标记物Indel20标记特征条带为324bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.8所示。


3.用于筛选具有甜瓜霜霉病抗性的甜瓜质资源的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或权利要求2所述Indel标记物的引物；
所述引物扩增的甜瓜抗霜霉病Indel标记特征条带为251bp或231bp或349bp或324bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.3、SeqIDNo.4、SeqIDNo.7、SeqIDNo.8所示。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂。


5.用于筛选具有甜瓜霜霉病抗性的甜瓜种质资源的方法，其特征在于，采用权利要求1及权利要求2所述的Indel标记或权利要求3-4任一所述的试剂盒进行如下步骤：
(1)利用CTAB法提取甜瓜待测样品任意组织或器官的基因组D...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学军，伊鸿平，杨永，李寐华，凌悦铭，张永兵，张红，杨文莉，范蓉，闫淼，
申请(专利权)人：新疆农业科学院哈密瓜研究中心，
类型：发明
国别省市：新疆;65