一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组、试剂盒及检测方法。所述引物探针组包括上游引物、下游引物及探针，其中上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。所述检测方法包括：提取DNA作为反应的模板；采用所述的引物和探针进行实时荧光PCR检测。本发明专利技术通过设计一组葡萄座腔菌特异性引物和探针，并对反应体系进行了优化，建立了针对该菌株实时荧光定性检测的方法，能够在受到单一病原菌或复合侵染的样本中检测出该病原真菌。

【技术实现步骤摘要】
一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及海关检验检疫
，特别是涉及一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组、试剂盒及检测方法。
技术介绍
葡萄座腔菌属真菌寄主范围广泛，不仅存在于土壤中也作为内生真菌寄生于健康植株，遇到适宜环境条件便侵染植株引发病害，导致植株发生枯萎、腐烂和溃疡等病害。苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeriastevensii)，属于葡萄座腔菌属，鉴于其对国内果蔬生产安全的危害性，已列入我国进境检疫性有害生物名录，属于口岸重点关注检疫病害。口岸对病原菌的准确、快速检测鉴定是防范该病原菌入侵危害的重要基础，然而利用传统的病原菌分离方法对病样进行分离鉴定，需要消耗大量时间，同时要求鉴定人员具备专业的病原菌鉴定技能。葡萄座腔菌可用于分类的有性态特征较少，且很难用培养基培养，因此目前鉴定葡萄座腔菌主要根据其无性态特征来进行鉴定，但是该属真菌无性态特征不稳定，容易受环境条件的影响。因此，开发一种对该类真菌快速、准确的检测方法，对病害的管控具有重要的意义。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的在于提供了一种快速、准确的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组、试剂盒及检测方法。在本专利技术的一方面，提供一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组，所述引物探针组包括上游引物、下游引物及探针，其中上游引物的DNA序列如SEQIDNO.1所示；下游引物的DNA序列如SEQIDNO.2所示；所述探针的DNA序列如SEQIDNO.3所示。进一步地，前述的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组中，其中所述探针的5'端修饰有荧光报告基团5`6-FAM、5`HEX或5`VIC；3'端修饰有含有不发荧光的淬灭基团3`BHQ1、3`BHQ2或3`BHQ3。在本专利技术的另一方面，提供一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测试剂盒，其包括上述的引物探针组。进一步地，前述的实时荧光PCR检测试剂盒中，其中还包括2×TaqmanExpressPCRMasterMix和1-2μg/ml的阳性对照。进一步地，前述的实时荧光PCR检测试剂盒中，其中所述上游引物、下游引物、探针以引物探针混合液的形式存在，均溶解在同一TE缓冲液中。进一步地，前述的实时荧光PCR检测试剂盒中，其中所述上游引物的工作浓度为10μmol/L，下游引物的工作浓度为10μmol/L，探针的工作浓度为10μmol/L。在本专利技术的另一方面，提供一种不以疾病诊断为目的的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：S1.提取DNA作为反应的模板；S2.采用所述的引物和探针进行实时荧光PCR检测。进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法中，其中步骤S1中，所述提取DNA的步骤包括：1)采集待测样本：将待测样本充分研磨至粉末状，加TE缓冲液稀释后，得到研磨液；2)提取样本基因组：采用磁珠法提取研磨液中的DNA，获得待测样本的模板DNA。进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法中，其中所述待测样本为植物发病部位组织或干重组织，其与TE缓冲液的重量比例为1：1-1：5；所述研磨的粒度为40-60微米。进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法中，其中步骤2)中，所述磁珠法是通过植物基因组DNA提取试剂盒进行的。进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法中，其中步骤S2中，所述实时荧光PCR检测反应体系为25μL：模板DNA2μl，2×TaqmanExpressPCRMasterMix，12.5μl；10μmol/L所述的引物各1μL，10μmol/L所述的探针0.5μL，和无菌水8μL。进一步地，前述的不以疾病诊断为目的的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法中，其中步骤S2中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火/延伸1min，共40个循环，并收集荧光信号。在实时荧光PCR仪上进行扩增，Ct值由仪器自动得出。本专利技术原理在于选择特殊设计的引物，设计荧光基团来修饰探针，从而为检测苹果壳色单隔孢溃疡病菌Botryosphaeriastevensii提供新的检测方法。本专利技术相比于现有技术至少具有以下有益效果：本专利技术利用一组特异性的引物、探针，通过将微量的DNA大幅增加来进行检测，特异性强、灵敏度高，可提高结果准确性。本专利技术通过设计一组苹果壳色单隔孢溃疡病菌特异性引物和探针，并对反应体系进行了优化，建立了针对该菌株实时荧光定性检测方法，能够在受到单一病原菌或至少两种病原菌复合侵染的样本中检测出该病原真菌，而且在2小时内即可完成检测，提高了工作效率，特别符合国境口岸快速检测、快速通关的需求。本专利技术将纳米磁微粒(磁珠法)运用于真菌核酸提取中，使得真菌核酸提取更加操作简单、高效，同时与实时荧光检测技术相结合，针对用户快检需求，形成了一套操作性强的解决方案。目前，该方法在口岸已经得到推广应用，并且成功在日本入境旅客携带的水果中截获该病原菌。因此，本专利技术具有良好的市场应用前景和推广应用价值。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。附图说明图1为本专利技术实时荧光定量PCR特异性检测结果图。图2为本专利技术实时荧光定量PCR灵敏度检测结果图。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术为达成预定专利技术目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本专利技术提出的一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法及检测用引物探针组、试剂盒其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征或特点可由任何合适形式组合。以下材料或试剂，如非特别说明，均为市购。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但并不因此而限制本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。本专利技术提供一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组，所述引物探针组包括上游引物、下游引物及探针，其中上游引物的DNA序列如SEQIDNO.1所示；下游引物的DNA序列如SEQIDNO.2所示；所述探针的DNA序列如SEQIDNO.3所示。具体实施时，所述探针的5'端修饰有荧光报告基团5`6-FAM、5`HEX或5`VIC，优选为荧光报告基团5`6-FAM；3'端修饰有含有不发荧光的淬灭基团3`BHQ1、3`本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括上游引物、下游引物及探针，其中上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测用引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括上游引物、下游引物及探针，其中上游引物的DNA序列如SEQIDNO.1所示；下游引物的DNA序列如SEQIDNO.2所示；所述探针的DNA序列如SEQIDNO.3所示。


2.如权利要求1所述的实时荧光PCR检测用引物探针组，其特征在于，所述探针的5'端修饰有荧光报告基团5`6-FAM、5`HEX或5`VIC，3'端修饰有含有不发荧光的淬灭基团3`BHQ1、3`BHQ2或3`BHQ3。


3.一种苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的引物探针组。


4.如权利要求3所述的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括2×TaqmanExpressPCRMasterMix和1-2μg/ml的阳性对照。


5.如权利要求3所述的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物、探针以引物探针混合液的形式存在，均溶解在同一TE缓冲液中。


6.如权利要求3所述的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物的工作浓度为10μmol/L，下游引物的工作浓度为10μmol/L，探针的工作浓度为10μmol/L。


7.一种不以疾病诊断为目的的苹果壳色单隔孢溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑春生，高文娜，骆卫峰，刘冰，
申请(专利权)人：中国海关科学技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11