一种不同产地竹节参快速鉴定的分子方法技术

本发明专利技术属于竹节参分子鉴定技术领域，公开了一种不同产地竹节参快速鉴定的分子方法，利用植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒进行竹节参DNA提取；选用ITS片段的引物进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行双向测序；以ITS全长作为标准序列，将测序得到的序列与标准序列进行比对，修剪，获得完整的片段序列；利用Chromatogram2.3软件进行测序峰图的查看和序列文本的提取；利用DNAman软件进行多序列对比、修剪；利用BLAST在线搜索页对测序结果进行初步搜索；利用MEGA4.0软件进行系统发育树构建。本发明专利技术快速，且准确率高，可辅助竹节参道地药材的形态分类、鉴定以及真伪品的鉴定等。

【技术实现步骤摘要】
一种不同产地竹节参快速鉴定的分子方法
本专利技术属于竹节参分子鉴定
，尤其涉及一种不同产地竹节参快速鉴定的分子方法。
技术介绍
目前，竹节参(PanaxjaponicusC.A.Mey.)又名竹节三七、竹节人参、白三七等，为五加科人参属多年生植物，主要分布于湖北、贵州、云南、陕西、甘肃、安徽等中、南地区，兼具北药人参和南药三七的功效，既补气又补血，被民间誉为“草药之王”，竹节参主要含有丰富的皂苷类成分，如人参皂苷、竹节参皂苷、伪人参皂苷等，此外，还含有丰富的多糖、有机酸、氨基酸以及少量的挥发油等成分。以根茎入药，具有散瘀止血，消肿止痛，提高机体免疫力，延缓衰老，并具有护肝、抗炎、抗疲劳、抗肿瘤等疗效。由于诸多因素，野生竹节参的资源逐年减少，目前已处于濒危状态。而栽培资源主要在湖北恩施及周边小范围存在，实际规模较小，加上长达6年的生长周期，造成目前市场供需矛盾突出，价格快速上升，因此，极具开发价值。中药材基源物种与同属的近缘物种或因药材外形相似，或因药材性味功能相近而互相混用，代用品或混伪品较多，如市场上经常出现栌兰根、商陆根、紫茉莉根和野红豆根等冒充人参，这严重影响到患者的临床疗效以及中医用药的安全。因此，亟需一种快速鉴定中药材真伪的方法。目前，药用植物的DNA条形码鉴定研究得到快速发展，广泛应用于多个科属的药用植物及中药材鉴定。目前利用DNA条形码技术揭示不同产地竹节参亲缘关系和系统发育关系的资料还少见于报道，通过DNA条形码技术，构建不同产地竹节参系统发育树，可依据不同产地竹节参的序列差异用于道地性药材的分类、鉴定以及竹节参真伪品的鉴别等。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前利用DNA条形码技术揭示不同产地竹节参亲缘关系和系统发育关系的资料还少见于报道。解决以上问题及缺陷的难度为：目前，中药材竹节参真伪鉴别多依托形态观察、鉴定，这需要很深的专业基础，一般人员很难准确鉴定，再加上市场上中药材竹节参多为干品，更加难以准确鉴定。解决以上问题及缺陷的意义为：传统中药材竹节参真伪鉴定大多依托有经验人员从形态上进行鉴定，一般人员难以准确鉴定。植物遗传物质DNA比较稳定，不会随着竹节参形态变化而发生改变，通过DNA条形码技术可以快速、准确对中药材竹节参进行鉴定。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种不同产地竹节参快速鉴定的分子方法。本专利技术是这样实现的，一种不同产地竹节参快速鉴定的分子方法，所述不同产地竹节参快速鉴定的分子方法包括以下步骤：步骤一，利用植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒进行竹节参DNA提取，进行纯度和浓度测定后，于-20℃保存备用；步骤二，选用ITS片段的引物进行PCR扩增，PCR反应用50μL体系；PCR结束后对PCR扩增产物进行双向测序；步骤三，在NCBI中搜索人参的ITS全长，以ITS全长作为标准序列，将测序得到的序列运用DNAMAN软件与标准序列进行比对，并对合格的序列进行修剪，获得完整的片段序列；步骤四，利用Chromatogram2.3软件进行测序峰图的查看和序列文本的提取；利用DNAman软件进行多序列对比、修剪；步骤五，利用BLAST在线搜索页对测序结果进行初步搜索，确认测序准确性；利用MEGA4.0软件进行系统发育树构建。进一步，步骤一中，选择5年生以上的野生竹节参健康、无病害叶片进行DNA提取。进一步，步骤一中，所述提取得到的DNA在使用时，用TE稀释至50ng·μL-1。进一步，步骤二中，所述ITS片段的引物包括引物ITS4和引物ITS5，所述引物ITS4的基因序列如SEQIDNO：1所示，所述引物ITS5的基因序列如SEQIDNO：2所示。进一步，步骤二中，所述PCR反应体系包括预混合液25μL，模板DNA1μL，引物对2μL×2，ddH2O20μL。进一步，所述预混合液含有Taq酶、dNTP和优化的反应缓冲液。进一步，所述模板DNA的浓度为50ng·μL-1，所述引物对的浓度为5μmol·μL-1。进一步，步骤二中，所述PCR扩增程序，包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环；最后72℃延伸2min。进一步，步骤二中，所述PCR反应在EppendorfMastercyclerpros循环仪上进行；其中，所述Marker为Trans2kDNAmarker。进一步，步骤三中，所述人参ITS全长基因序列如SEQIDNO：3所示。结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：本专利技术提供的不同产地竹节参快速鉴定的分子方法，所有样品均为双向测序，以保证序列的准确性，所有样品峰图都很好，无套峰、杂峰现象，测序结果质量较好，满足实验要求；不同产地竹节参ITS变异较大，ITS序列不仅可用于人参属植物的分类鉴定，也可用于不同产地竹节参分类鉴定，尤其可用于竹节参道地性药材的快速分子鉴定。本专利技术提供的竹节参ITS序列在不同产地变异较大，系统发育树(NJ树)显示不同产地竹节参基本能够单独聚类，表明ITS序列可用于竹节参种甚至种下水平的分类、鉴定研究，此外，系统发育显示竹节参与人参关系较近，与三七关系较远，而且竹节参与三七在地理分上有重叠区域，因此，表明竹节参进化路线可能是由北向南。通过实验结果表明，引物ITS4-ITS5(ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATG，ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)可用于不同产地竹节参的分类、鉴定以及竹节参道地性药材的分子鉴定等方面研究。该方法不仅快速，而且准确率高，可辅助竹节参道地药材的形态分类、鉴定以及真伪品的鉴定等。对比的技术效果或者实验效果。包括：传统中药材竹节参真伪鉴定大多依托有经验人员从形态上进行鉴定，一般人员难以准确鉴定，与传统药材竹节参真伪鉴定相比，依托分子手段(DNA条形码技术)，只需要一对引物ITS4-ITS5扩增出ITS序列，就能够对竹节参进行快速、准确的鉴定。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对本专利技术实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例提供的不同产地竹节参快速鉴定的分子方法流程图。图2(a)-图2(e)是本专利技术实施例提供的引物ITS4-ITS5合成的其中1个竹节参样品完整序列峰图。图3是本专利技术实施例提供的基于ITS序列构建的NJ系统发育树示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种不同产地竹节参快速鉴定的分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不同产地竹节参快速鉴定的分子方法，其特征在于，所述不同产地竹节参快速鉴定的分子方法包括：/n步骤一，利用植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒进行竹节参DNA提取，进行纯度和浓度测定后，于-20℃保存备用；/n步骤二，选用ITS片段的引物进行PCR扩增，PCR反应用50μL体系；PCR结束后对PCR扩增产物进行双向测序；/n步骤三，在NCBI中搜索人参的ITS全长，以ITS全长作为标准序列，将测序得到的序列运用DNAMAN软件与标准序列进行比对，并对合格的序列进行修剪，获得完整的片段序列；/n步骤四，利用Chromatogram2.3软件进行测序峰图的查看和序列文本的提取；利用DNAman软件进行多序列对比、修剪；/n步骤五，利用BLAST在线搜索页对测序结果进行初步搜索，确认测序准确性；利用MEGA4.0软件进行系统发育树构建。/n

【技术特征摘要】
1.一种不同产地竹节参快速鉴定的分子方法，其特征在于，所述不同产地竹节参快速鉴定的分子方法包括：
步骤一，利用植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒进行竹节参DNA提取，进行纯度和浓度测定后，于-20℃保存备用；
步骤二，选用ITS片段的引物进行PCR扩增，PCR反应用50μL体系；PCR结束后对PCR扩增产物进行双向测序；
步骤三，在NCBI中搜索人参的ITS全长，以ITS全长作为标准序列，将测序得到的序列运用DNAMAN软件与标准序列进行比对，并对合格的序列进行修剪，获得完整的片段序列；
步骤四，利用Chromatogram2.3软件进行测序峰图的查看和序列文本的提取；利用DNAman软件进行多序列对比、修剪；
步骤五，利用BLAST在线搜索页对测序结果进行初步搜索，确认测序准确性；利用MEGA4.0软件进行系统发育树构建。


2.如权利要求1所述的不同产地竹节参快速鉴定的分子方法，其特征在于，步骤一中，选择5年生以上的野生竹节参健康、无病害叶片进行DNA提取。


3.如权利要求1所述的不同产地竹节参快速鉴定的分子方法，其特征在于，步骤一中，所述提取得到的DNA在使用时，用TE稀释至50ng·μL-1。


4.如权利要求1所述的不同产地竹节参快速鉴定的分子方法，其特征在于，步骤二中，所述ITS片段的引物包括引物ITS4和引物ITS5，所述引物IT...

【专利技术属性】
技术研发人员：付涛，陈际伸，刘峰，吴立威，易官美，胡仲义，
申请(专利权)人：宁波城市职业技术学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33