本发明专利技术公开了柳杉不同组织的荧光定量内参基因及其专用引物和应用，属于植物分子生物学技术领域。该荧光定量内参基因为UBI、CYP和SDH1基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术通过柳杉转录组数据筛选了12个候选内参基因基因序列，利用三款内参基因稳定性评测软件对候选内参基因的稳定性进行评估，获得了柳杉不同组织的实时荧光定量PCR的最适基因UBI、CYP和SDH1。并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，能够大大的提高采用实时荧光定量检测柳杉基因时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。
【技术实现步骤摘要】
柳杉不同组织的荧光定量内参基因及其专用引物和应用
本专利技术属于植物分子生物学
，具体涉及柳杉不同组织的荧光定量内参基因及其专用引物和应用。
技术介绍
实时荧光定量PCR(qRT-PCR)由于其灵敏度高、重复性强、特异性强、快速和高效的特点，成为研究基因表达的主要方法。但qRT-PCR会受到RNA纯度、数量和反转录效率的影响，因此需要引入内参基因作为标准以准确量化基因表达。内参基因是指在理想情况下，其在植物不同组织、不同生长阶段和不同条件处理下都能够稳定表达，且不受外界环境影响的基因。目前已有大量报道鉴定出了多种植物的合适内参基因。柳杉(CryptomeriafortuneiHooibrenk)，又名长叶孔雀松，杉科柳杉属，是我国重要的工业用材和园林绿化树种。在对柳杉的分子生物学研究过程中，难免会涉及到柳杉基因表达的研究，但关于使用qRT-PCR分析和验证柳杉基因表达水平所使用的内参基因的报道基本没有，而稳定的内参基因是保证qRT-PCR结果准确的关键因素，因此有必要鉴定出适合柳杉不同组织荧光定量的内参基因用于柳杉的基因表达研究。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的第一技术问题是提供柳杉不同组织的荧光定量内参基因，能够应用在柳杉不同组织的实时荧光定量中；本专利技术所要解决的第二技术问题是提供柳杉不同组织的荧光定量内参基因的专用引物；本专利技术所要解决的第三技术问题是提供上述内参基因或专用引物在柳杉荧光定量中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：柳杉不同组织的荧光定量内参基因，为UBI、CYP和SDH1基因，UBI基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；CYP基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；SDH1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。所述的柳杉不同组织的荧光定量内参基因的专用引物，UBI基因的引物序列如下：UBI正向引物：5’-CGTTAAAGCCAAGATCCAGGACAA-3’；UBI反向引物：5’-TCCATCCTCAAGCTGTTTCCC-3’；CYP基因的引物序列如下：CYP正向引物：5’-GCCATTTCCACAGGGTTATCAAG-3’；CYP反向引物：5’-GCCATAGAAAGGAGACCAGGAC-3’；SDH1基因的引物序列如下：SDH1正向引物：5’-GCCAATACCTGTCTTGCCAAC-3’；SDH1反向引物：5’-CTCTCCAGCAGCCATTAGTCC-3’。所述的柳杉不同组织的荧光定量内参基因在柳杉荧光定量中的应用。所述的柳杉不同组织的荧光定量内参基因的专用引物在柳杉荧光定量中的应用。有益效果：相比于现有技术，本专利技术的优点为：本专利技术通过柳杉转录组数据筛选了12个候选内参基因基因序列，利用三款内参基因稳定性评测软件(geNorm、NormFinder和BestKeeper)对候选内参基因的稳定性进行评估，获得了柳杉不同组织的实时荧光定量PCR的最适基因UBI、CYP和SDH1。并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，能够大大的提高采用实时荧光定量检测柳杉基因时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。附图说明图1是12个内参基因在柳杉不同组织中的Ct值；图2是geNorm软件分析内参基因表达稳定性；图3是geNorm软件分析的最佳内参基因的数目；图4是稳定性较好的3个基因UBI、CYP和SDH1以及不稳定基因18SrRNA作为内参基因，分析柳杉不同组织中CESA基因的表达量；图5是稳定性较好的3个基因UBI、CYP和SDH1以及不稳定基因18SrRNA作为内参基因，分析柳杉不同组织中CHS基因的表达量；图6是为稳定性较好的3个基因UBI、CYP和SDH1以及不稳定基因18SrRNA作为内参基因，分析柳杉不同组织中PYL基因的表达量。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。以下实施例中如无特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1柳杉不同组织中表达最稳定的内参基因的筛选包括如下步骤：1、供试材料取样：采集南京林业大学白马基地生长良好的柳杉，并在2020年7月采集柳杉根、茎、叶和果，用干冰保存后带回实验室，放置-80℃冰箱保存。2、不同组织总RNA的提取：采用百泰克生物技术公司的通用型总RNA提取试剂盒按照说明书提取柳杉不同组织的总RNA。3、cDNA第一链的合成：采用诺唯赞生物科技有限公司的cDNA反转录试剂盒(IIIRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)R323-01)将总RNA反转eDNA，作为荧光定量PCR的模板。1)在RNase-free离心管中配置如下混合液：4xgDNAwiperMix4μL，模板RNA1pg-1ug，加RNase-freeddH2O至16μL；2)用移液器轻轻吹打均匀，反应混合物在42℃水浴2min；3)然后加入5xHiScriptIIIqRTSuperMix4μL；4)用移液枪轻轻吹打均匀；5)在PCR仪按照下列条件进行反转录反应：37℃，15min；85℃，15sec；6)将上述溶液-20℃保存。4、通过查阅文献资料暂定候选内参基因，并根据柳杉转录组数据的注释信息筛选表达量较高的候选内参基因。将已筛选的候选内参基因在NCBI网站上进行比对，选择同源性最高的基因。最终筛选出12个内参基因，分别为泛素基因(UBI)、肌动蛋白基因(ACT)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、转录延伸因子的编码蛋白(EF1α)、18S核糖体RNA(18SrRNA)、F-box家族蛋白(FBOX)、β-肌动蛋白(β-actin)、α-tubulin(TUBA)、亲环蛋白(CYP)、琥珀酸脱氢酶(SDH1)、β-tubulin(TUBB)和泛素结合酶基因(UBC)。5、根据获得的候选基因序列设计该基因相应的特异性引物。引物通过Primer5.0设计，参数设计如下：扩增长度100-250bp，溶解温度在50-62℃，GC含量在40％-60％之间，并委托擎科生物技术公司合成引物。内参基因及引物序列如下表1所示。表112个内参基因名和引物序列5、荧光定量PCR反应：以反转的cDNA为模板，用内参基因相应的特异性引物在AppliedBiosystems(ABI)7500FastReal-TimePCR系统(AppliedBiosystems)中进行扩增。获得各个基因的Ct值。qRT-PCR使用AppliedBiosystems7本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.柳杉不同组织的荧光定量内参基因，其特征在于，为UBI、CYP和SDH1基因，UBI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；CYP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；SDH1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。/n
【技术特征摘要】
1.柳杉不同组织的荧光定量内参基因，其特征在于，为UBI、CYP和SDH1基因，UBI基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；CYP基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；SDH1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
2.权利要求1所述的柳杉不同组织的荧光定量内参基因的专用引物，其特征在于，
UBI基因的引物序列如下：
UBI正向引物：5’-CGTTAAAGCCAAGATCCAGGACAA-3’；
UBI反向引物：5’-TCCATCCTCAAGCTGTTTCCC-3’；
CYP基因的引物序列如下：
【专利技术属性】
技术研发人员：徐进，胡海亮，崔洁冰，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。