激素胁迫下柳杉荧光定量内参基因及其引物的应用制造技术

本发明专利技术公开了激素胁迫下柳杉荧光定量内参基因及其引物的应用，属于植物分子生物学领域。本发明专利技术通过检索文献资料和数据库选择并设计了本发明专利技术的15条候选内参基因，并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物。通过delta‑CT、GeNorm、NormFinder和BestKeeper四个软件对候选内参基因评价稳定性，并结合RefFinder进行综合分析，获得柳杉在SA、ABA、MeJA、GA

【技术实现步骤摘要】
激素胁迫下柳杉荧光定量内参基因及其引物的应用
本专利技术属于植物分子生物学领域，更具体地说，涉及激素胁迫下柳杉荧光定量内参基因及其引物的应用。
技术介绍
柳杉(CryptomeriafortuneiHooibrenkexOttoetDietr)，又名长叶孔雀松。乔木，其天然分布极其狭窄，主要分布在我国及日本等地。柳杉因其树形优美、材质优良、适应性强、生长快而持久，已成为我国高海拔地区的主要造林树种之一，具有广阔的应用前景。水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和GA3是植物体内普遍存在的内源信号分子，在植物的生长发育方面发挥着重要的作用，如促进衰老以及抑制生长等有显著的促进作用；同时能诱导与生物抗逆境作用相关的物质的形成，从而调剂植物的逆境胁迫。然而现在关于柳杉在不同激素胁迫情况下基因表达的差异的研究报道甚少，在此过程中，涉及到运用实时荧光定量技术分析和验证基因的表达水平，就需要稳定可靠的内参基因，因此筛选柳杉激素胁迫下稳定表达的内参基因是实时荧光定量结果准确的关键因素。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供激素胁迫下荧光定量内参基因的应用，能够满足实时荧光定量检测柳杉基因转录表达水平的要求。本专利技术所要解决的另一问题是提供上述内参基因的引物在柳杉荧光定量中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：激素胁迫下柳杉荧光定量内参基因的应用，所述的激素胁迫是SA胁迫、ABA胁迫、MeJA胁迫下或GA3胁迫。所述SA胁迫下柳杉荧光定量内参基因的应用，所述内参基因为Actin、UBC和/或CYP基因，Actin基因的基因序列如SEQIDNO.1所示；UBC基因的基因序列如SEQIDNO.2所示；CYP基因的基因序列如SEQIDNO.3所示。所述ABA胁迫下柳杉荧光定量内参基因的应用，所述内参基因为CYP和/或Actin基因，CYP基因的基因序列如SEQIDNO.3所示；Actin基因的基因序列如SEQIDNO.1所示。所述MeJA胁迫下柳杉荧光定量内参基因的应用，所述内参基因为UBC、CYP和/或18S基因，UBC基因的基因序列如SEQIDNO.2所示；CYP基因的基因序列如SEQIDNO.3所示，18S基因的基因序列如SEQIDNO.4所示。所述GA3胁迫下柳杉荧光定量内参基因的应用，所述内参基因为UBC和/或CYP基因，UBC基因的基因序列如SEQIDNO.2所示；CYP基因的基因序列如SEQIDNO.3所示。柳杉Actin基因的引物序列在柳杉荧光定量中的应用，Actin基因的引物序列如下：Actin正向引物：5′-GTTGCCATTCAAGCCGTTCT-3′，Actin反向引物：5′-AACAATTTCACGCTCAGCAGTAG-3′。柳杉UBC基因的引物序列在柳杉荧光定量中的应用，UBC基因的引物序列如下：UBC正向引物：5′-CTCGCAGAATCATAAAGGAAACAC-3′，UBC反向引物：5′-CCATTGGATACTCTTCAGGCAAA-3′。柳杉CYP基因的引物序列在柳杉荧光定量中的应用，CYP基因的引物序列如下：CYP正向引物：5′-TCTCGGGCAGCATTTCACGC-3′，CYP反向引物：5′-AGCCGAAACTGGCGCCAACA-3′。柳杉18S基因的引物序列在柳杉荧光定量中的应用，18S基因的引物序列如下：18S正向引物：5′-TCTGGTCCTGTTCCGTTGG-3′，18S反向引物：5′-GCTTTCGCAGTGGTTCGTC-3′。相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术通过文献资料查阅和数据库搜索，确定了15个参考基因作为候选基因，并筛选了内参基因的基因序列，通过5种算法(delta-CT、geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder)评估候选基因的稳定性，获得了适用于柳杉不同激素胁迫下荧光定量内参基因，并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，能够大大的提高采用实时荧光定量检测柳杉基因时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。附图说明图1是不同激素处理下15个内参基因的GQ值图，A：SA胁迫；B：ABA胁迫；C：MeJA胁迫；D：GA3胁迫；图2是不同激素处理下geNorm软件对15个内参基因表达稳定值(M)排序，稳定值越低，基因表示越稳定的结果图分析，A：SA胁迫；B：ABA胁迫；C：MeJA胁迫；D：GA3胁迫；图3是不同激素处理下geNorm确定用于准确量分析最优的内参基因数目，A：SA胁迫；B：ABA胁迫；C：MeJA胁迫；D：GA3胁迫；图4是不同激素胁迫下稳定基因以及不稳定基因做内参基因，MAKP1基因的表达量，A：SA胁迫；B：ABA胁迫；C：MeJA胁迫；D：GA3胁迫。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。以下实施例所采用的供试材料为：选取72株长势一致的6年生柳杉苗(分成四组每组18株)。其是以江西大岗山生长状态良好的无病虫害的柳杉作为母树，在2019年6月，经过以下操作获得的：首先剪取当年生、带2～3个侧芽的半木质化枝条作插穗(12-16cm)，上切口平切，下切口45°斜切；然后用蒸馏水浸泡12h，1％次氯酸钠10分钟，蒸馏水冲洗3次，用0.1g·L-1GGR生根粉浸泡4h；最后将柳杉插穗扦插于南京林业大学白马基地温室内，土壤基质为1∶1∶1∶1的草炭、珍珠岩、蛭石和黄沙，并且每周进行两次喷灌水。将四组柳杉幼苗分别用200μM水杨酸(SA)，200μM茉莉酸甲酯(MeJA)、200μM脱落酸(ABA)和200μMGA3均匀喷洒，直至叶片完全湿润(每株150mL)；并将苗子在25℃且具有相同光周期(12-hlight/12-hdarkcycle)及湿度(60％)的光照培养箱中培养。做三个生物学重复。分别于胁迫后的第0、2、6、12、24和48h取样。在收集样品时，用液氮快速冷冻，然后保存在-80℃进行进一步的分析。实施例11、柳杉总RNA提取与cDNA合成按百泰克生物技术有限公司的总RNA提取试剂盒说明书提取各样品的总RNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计(NanoDrop2000，ThermoScientifc，Wilmington，DE，USA)检测其完整性、纯度和浓度。以0.8μgRNA总RNA为模板，使用RT-qPCR专用预混液试剂盒(IIIRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)合成第一链cDNA，储存于-20℃冰箱中待用。2、内参基因的选择及其引物的设计通过文献资料查阅和数据库搜索，将已经报道用于其他物种的内参基因与柳杉RNAseq数据进行本地blast比对(b本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.激素胁迫下柳杉荧光定量内参基因的应用，其特征在于，所述的激素胁迫是SA胁迫、ABA胁迫、MeJA胁迫下或GA

【技术特征摘要】
1.激素胁迫下柳杉荧光定量内参基因的应用，其特征在于，所述的激素胁迫是SA胁迫、ABA胁迫、MeJA胁迫下或GA3胁迫。


2.如权利要求1所述SA胁迫下柳杉荧光定量内参基因的应用，其特征在于，所述内参基因为Actin、UBC和/或CYP基因，Actin基因的基因序列如SEQIDNO.1所示；UBC基因的基因序列如SEQIDNO.2所示；CYP基因的基因序列如SEQIDNO.3所示。


3.如权利要求1所述ABA胁迫下柳杉荧光定量内参基因的应用，其特征在于，所述内参基因为CYP和/或Actin基因，CYP基因的基因序列如SEQIDNO.3所示；Actin基因的基因序列如SEQIDNO.1所示。


4.如权利要求1所述MeJA胁迫下柳杉荧光定量内参基因的应用，其特征在于，所述内参基因为UBC、CYP和/或18S基因，UBC基因的基因序列如SEQIDNO.2所示；CYP基因的基因序列如SEQIDNO.3所示，18S基因的基因序列如SEQIDNO.4所示。


5.如权利要求1所述GA3胁迫下柳杉荧光定量内参基因的应用，其特征在于，所述内参基因为UBC和/或CYP基因，UBC基因的基因序列如SEQIDNO.2所示；CYP基因的基因序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐进，薛金玉，张莹婷，杨俊杰，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32