一种发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产D‑氨基酸氧化酶的方法，属于生物酶制备技术领域。所述方法包括：以表达D‑氨基酸氧化酶的重组大肠杆菌为生产菌株，接种于发酵培养基中进行发酵培养，当溶解氧下降到1％以后采用DO‑STAT模式分批补料，DO设定值为10％～50％；发酵过程中添加10g/L‑50g/L的乳糖作为诱导剂，同时添加D‑氨基酸至发酵液中，继续培养至发酵结束后，收集胞内含有D‑氨基酸氧化酶的菌体。本发明专利技术通过分批补料发酵过程中添加高浓度乳糖作为诱导剂提高DAAO的酶活，同时添加适量D‑氨基酸减小DAAO对宿主细胞生长的抑制，大大提高了DAAO的生产效率，为工业化生产提供了条件。

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法
本专利技术涉及生物酶制备
，具体涉及一种利用基因工程菌发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法。
技术介绍
D-氨基酸氧化酶(DAAO，EC1.4.3.3)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基的黄酮酶，可在氧分子存在的情况下，催化具有绝对立体特异性的D-氨基酸的氧化脱氨反应，产生α-酮酸，氨和过氧化氢(H2O2)。由于其严格的立体选择性，DAAO已被用于生产非天然的L-氨基酸。L-氨基酸是药物合成中重要的中间体化合物。目前DAAO已经广泛用于工业催化制备L-氨基酸。例如，DAAO作为催化剂将头孢菌素C转化为7-氨基头孢菌酸(7-ACA)，7-ACA是合成许多β-内酰胺药物的关键化合物，这对工业生产7-ACA提供了便利。草铵膦(PPT)作为一种有机磷除草剂，具有低毒，安全性高和光谱广的优点。但是现在市场上售卖的草铵膦通常是外消旋的混合物，其中具有除草活性的只有L-异构体(L-PPT)，所以将外消旋草铵膦中的D-异构体(D-PPT)去除，将会提高除草效率，降低成本。DAAO作为一种高效的特异性反应催化剂，可以用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)以表达D-氨基酸氧化酶的重组大肠杆菌为生产菌株，活化后扩大培养，得到种子液；/n(2)将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，当溶解氧下降到1％以后采用DO-STAT模式分批补料，DO设定值为10％～50％；发酵过程中添加10g/L-50g/L的乳糖作为诱导剂，同时添加D-氨基酸至发酵液中，继续培养至发酵结束，收集胞内含有D-氨基酸氧化酶的菌体。/n

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以表达D-氨基酸氧化酶的重组大肠杆菌为生产菌株，活化后扩大培养，得到种子液；
(2)将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，当溶解氧下降到1％以后采用DO-STAT模式分批补料，DO设定值为10％～50％；发酵过程中添加10g/L-50g/L的乳糖作为诱导剂，同时添加D-氨基酸至发酵液中，继续培养至发酵结束，收集胞内含有D-氨基酸氧化酶的菌体。


2.如权利要求1所述的发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述扩大培养包括：将活化后的生产菌株接种于一级种子培养基中，一级种子培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，37℃振荡培养得到一级种子液，再将一级种子液按1％的接种量接种于二级种子培养基中，二级种子培养基组成为：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，KH2PO42.31g/L，K2HPO4·3H2O12.54g/L，37℃振荡培养得到二级种子液。


3.如权利要求1所述的发酵生产D-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵培养基的组成为：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，(NH4)2SO45g/L，K2HPO4·3H2O2.28g/L，KH2PO41.36g/L，MgSO4·7H2O0.375g/L，甘油12g/L，消泡剂1mL/L。


4.如权利要求1所述的发酵生产D-氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建妙，郑裕国，曹慧婷，薛亚平，程峰，邹树平，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33