一种人工抗原呈递纳米粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物学医药技术领域，具体涉及一种人工抗原呈递纳米粒，该主要有效成分为PEG和CD47‑Fc修饰的PLGA纳米粒、肿瘤靶抗原、抗CD28抗体，其中肿瘤靶抗原可以是根据肿瘤细胞的变化而变化，保证被激活和扩增的T细胞对相应肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，同时PLGA纳米粒表明的PEG和CD47‑Fc修饰可以使得本发明专利技术中的人工抗原提呈纳米粒拥有体内长循环和抗吞噬的优势。本发明专利技术还涉及人工抗原呈递纳米粒的制备方法，操作步骤简单、可重复性高、制备周期短，利于大批量生产。

【技术实现步骤摘要】
一种人工抗原呈递纳米粒及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物学医药
，尤其是涉及一种人工抗原呈递纳米粒及其制备方法和应用。
技术介绍
抗原提呈细胞(APC)，如树突状细胞(DC)，尽管在体内外都是扩增抗原特异性T细胞的有效工具，但仍存在许多缺陷并需要克服，如扩增技术困难、扩增周期长、资金花费大、非特异性刺激以及活细胞引起的生物安全性等问题。随着非细胞型人工抗原提呈细胞技术的迅速发展，近年来提出了纳米级人工抗原提呈细胞(artificialantigenpresentingcells，aAPC)的概念。相比细胞大小的aAPC，aAPC虽然具有更好的生物分布且栓塞率更低的优点，但更容易被巨噬细胞所摄取、与T细胞的接触表面积更小，导致aAPC扩增T细胞能力相对较弱。因此，如何对aAPC进行优化，提高其体内循环能力、抗吞噬能力以提高其扩增/活化T细胞的能力，进而诱导更完善的免疫反应是目前亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供了一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒，包括PEG化PLGA纳米粒，所述PEG化PLGA纳米粒表面修饰有CD47-Fc、肿瘤靶抗原和抗CD28抗体得到人工抗原呈递纳米粒。作为优选，所述人工抗原呈递纳米粒的粒径范围为20nm-500nm，不同所述人工抗原呈递纳米粒之间的粒径偏差在0nm-100nm范围内。作为优选，所述PLGA纳米粒表面修饰的PEG分子长度范围在800～6000。作为优选，所述PLGA纳米粒与PEG的重量份数比为1.5-2.0：0.03-0.01；PEG化PLGA纳米粒与CD47-Fc、肿瘤靶抗原和抗CD28抗体的重量份数比为5-10：0.03-0.01：0.03-0.01。在静脉给药时，本专利技术的人工抗原呈递纳米粒表面的PEG化和CD47-Fc分子可保证纳米粒在体内有较长的循环时间，并且纳米粒表面的CD47-Fc分子与吞噬细胞上的信号调节蛋白-α相互作用，减少吞噬细胞对人工抗原呈递纳米粒的吞噬，使其在体内可以持续高效的活化和扩增T细胞。且通过调整人工抗原呈递纳米粒的粒径大小和粒径均匀度即可轻松调整纳米粒表面修饰密度以及纳米粒与T细胞接触面积，以上调整能保证纳米粒在体内水平对T细胞起到更高效的活化和扩增作用。本专利技术的目的之二在于提供了一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒的制备方法，操作步骤包括：获得PEG化PLGA纳米粒，然后在表面活化剂的活化下，在所述PEG化PLGA纳米粒表面修饰肿瘤靶向抗原、抗CD28抗体和CD47-Fc得到人工抗原呈递纳米粒。作为优选，所述表面活化剂为(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺。作为优选，具体包括以下步骤：1)取5-10重量份PEG化的PLGA纳米粒溶液，与0.2-0.4重量份的EDC·HCl溶液和0.2-0.4重量份的NHS溶液混合，并在室温下搅拌1-4小时；接着将该混合物离心，离心条件为8000-12000rpm，5-10分钟，即得到沉淀物B；2)取5-20重量份的1％聚乙烯亚胺溶液将所述沉淀物B全部溶解，并在室温下搅拌4-12小时，接着离心沉淀，离心条件为8000-12000rpm，5-10分钟，即得到沉淀物C；3)取5-10重量份沉淀物C置于1mL的EP管中，用0.1-0.5重量份的PBS重悬沉淀物C，然后取0.03-0.01重量份的肿瘤靶抗原、0.03-0.01重量份的抗CD28抗体和0.03-0.01重量份的CD47-Fc，随后将该EP管置于转盘上旋转反应12-16小时，反应温度为4℃，接着再用2-5重量份的牛血清白蛋白对反应液进一步封闭12-16小时，反应温度为室温，最后将该封闭后的反应液离心，离心条件为8000-12000rpm，5-10分钟，并用去离子水清洗3次，即得最终的人工抗原呈递纳米粒。作为优选，所述PEG化的PLGA纳米粒溶液的制备方法包括以下步骤：1)取5-10重量份PLGA纳米粒，将其溶解在6-12重量份的等渗缓冲盐溶液中所述等渗缓冲盐溶液为pH＝4.5-6.0的0.1MMES；2)取0.2-0.4重量份的EDC·HCl溶液和0.2-0.4重量份的NHS溶液，并在室温下搅拌1-2小时，接着通过离心沉淀，离心条件为8000-12000rpm，5-10分钟，得到沉淀物A；3)取4-8重量份的去离子水将沉淀物A在室温下全部溶解，接着加入0.01-0.03重量份的NH2-PEG-COOH，并静置反应8-12小时后将该反应物离心，离心条件为8000-12000rpm，5-10分钟，离心后产物用4-8重量份的去离子水重悬，即得到PEG化的PLGA纳米粒溶液。作为优选，所述PLGA纳米粒的制备方法包括以下步骤：1)取5-10重量份PLGA溶解于5-10重量份的二氯甲烷中，并经过超声乳化，超声条件为每超声10-15秒停10秒，持续5-10个循环，形成PLGA溶液；2)取30-60重量份的1％PVA加入上述超声乳化后的PLGA溶液中并超声乳化，超声条件为每超声10-15秒停10秒，持续5-10个循环，得到乳化液A；3)取60-120重量份的0.5％PVA加入乳化液A并接着超声乳化，超声条件为每超声10-15秒停10秒，持续5-10个循环，得到乳化液B；4)乳化液B置于室温下用磁力搅拌器搅拌4-12h，得到乳化液C；5)用过量的去离子水通过离心沉淀，离心条件为4000-8000rpm，5-10分钟，重复3-5次，并冷冻干燥得到PLGA纳米粒。本专利技术方法操作步骤简单、可重复性高、制备周期短，利于大批量生产。且可通过调整超声乳化参数来控制人工抗原呈递纳米粒的粒径大小和粒径均匀度，从而保证人工抗原呈递纳米粒的表面修饰比处于较高水平，从而保证纳米粒在体内有较长的循环时间，并且可以减少吞噬细胞对人工抗原呈递纳米粒的吞噬，使其在体内可以持续高效的活化和扩增T细胞。本专利技术的目的之三在于提供了一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒的应用，其特征在于将上述人工抗原呈递纳米粒用于制备抗肿瘤药品。本专利技术的人工抗原呈递纳米粒可单独制成抗肿瘤药品也可作为活性成分与其他药物成分制备得到抗肿瘤药品，静脉给药后在体内持续高效地活化和扩增T细胞以诱导完善的免疫反应清楚体内的肿瘤细胞。综上所述，与现有技术相比本专利技术的有益效果为：1、在静脉给药时，本专利技术的人工抗原呈递纳米粒表面的PEG化和CD47-Fc分子可保证纳米粒在体内有较长的循环时间，并且纳米粒表面的CD47-Fc分子与吞噬细胞上的信号调节蛋白-α相互作用，减少吞噬细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒，其特征在于包括PEG化PLGA纳米粒，所述PEG化PLGA纳米粒表面修饰有CD47-Fc、肿瘤靶抗原和抗CD28抗体得到人工抗原呈递纳米粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒，其特征在于包括PEG化PLGA纳米粒，所述PEG化PLGA纳米粒表面修饰有CD47-Fc、肿瘤靶抗原和抗CD28抗体得到人工抗原呈递纳米粒。


2.根据权利要求1所述的一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒，其特征在于，所述人工抗原呈递纳米粒的粒径范围为20nm-500nm，不同所述人工抗原呈递纳米粒之间的粒径偏差在0nm-100nm范围内。


3.根据权利要求1所述的一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒，其特征在于，所述PLGA纳米粒表面修饰的PEG分子量为800～6000。


4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒，其特征在于，所述PLGA纳米粒与PEG的重量份数比为1.5-2.0：0.03-0.01；PEG化PLGA纳米粒与CD47-Fc、肿瘤靶抗原和抗CD28抗体的重量份数比为5-10：0.03-0.01：0.03-0.01。


5.一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒的制备方法，其特征在于制备如权利要求1-3任意一项具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒，操作步骤包括：获得PEG化PLGA纳米粒，然后在表面活化剂的活化下，在所述PEG化PLGA纳米粒表面修饰肿瘤靶向抗原、抗CD28抗体和CD47-Fc得到人工抗原呈递纳米粒。


6.根据权利要求5所述的一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒的制备方法，其特征在于，所述表面活化剂为(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺。


7.根据权利要求6所述的一种具有长循环、抗吞噬作用的人工抗原呈递纳米粒的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
1)取5-10重量份PEG化的PLGA纳米粒溶液，与0.2-0.4重量份的EDC·HCl溶液和0.2-0.4重量份的NHS溶液混合，并在室温下搅拌1-4小时；接着将该混合物离心，离心条件为8000-12000rpm，5-10分钟，即得到沉淀物B；
2)取5-20重量份的1％聚乙烯亚胺溶液将所述沉淀物B全部溶解，并在室温下搅拌4-12小时，接着离心沉淀，离心条件为8000-12000rpm，5-10分钟，即得到沉淀物C；
3)取5-10重量份沉淀物C置于1mL的EP管中，用0.1-0.5重量份的PBS重悬沉淀物C，然后向其中加入0.03-0.01重量份的肿瘤靶...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨文君，俞建东，
申请(专利权)人：浙江康佰裕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33