制备负载mRNA的脂质纳米颗粒的改进方法技术

本发明专利技术提供了用于进行脂质纳米颗粒调配和mRNA包封的改进方法。在一些实施方案中，本发明专利技术提供了将信使RNA(mRNA)包封在脂质纳米颗粒中的方法，所述方法包括以低浓度混合预先形成的脂质纳米颗粒和mRNA的溶液的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备负载mRNA的脂质纳米颗粒的改进方法相关申请的交叉引用本申请要求于2018年8月29日提交的美国临时申请序列号62/724,582以及于2018年8月31日提交的美国临时申请序列号62/725,765的优先权，将这些美国临时申请中每一个的内容并入本文。以引用方式并入序列表于2019年8月16日创建并且大小为17KB的命名为“MRT_2030WO_Seq_Listing_ST25.txt”的文本文件的内容据此整体以引用方式并入。
技术介绍
信使RNA疗法(MRT)正在成为治疗多种疾病的越来越重要的方法。MRT涉及向需要所述疗法的患者施用信使RNA(mRNA)，以在患者体内产生由所述mRNA编码的蛋白质。通常将脂质纳米颗粒用于封装mRNA以实现mRNA的有效体内递送。为了改善脂质纳米颗粒的递送，许多努力集中在鉴定可以影响例如在各种类型的哺乳动物组织、器官和/或细胞(例如，哺乳动物肝细胞)中的细胞内递送和/或mRNA表达的新型脂质或特定脂质组合物上。但是，这些现有方法昂贵、费时且不可预测。
技术实现思路
本专利技术尤其提供了通过将预先形成的脂质纳米颗粒(LNP)与mRNA混合来制备负载mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的进一步改进的方法。本专利技术基于令人惊讶的发现，即在混合步骤期间降低预先形成的LNP和/或mRNA的浓度提供了意想不到的益处，诸如避免LNP聚集体的形成和/或减小脂质纳米颗粒的尺寸，同时维持包封效率和mRNA回收率。本专利技术特别地可用于制造具有较低水平的PEG修饰的脂质的mRNA-LNP用于治疗用途。因此，在一个方面，本专利技术提供了将信使RNA(mRNA)包封在脂质纳米颗粒中的方法，所述方法包括：混合包含预先形成的脂质纳米颗粒和mRNA的溶液，使得形成包封mRNA的脂质纳米颗粒，其中所述预先形成的脂质纳米颗粒和/或所述mRNA以不大于0.5mg/ml的浓度存在于所述溶液中。在一些实施方案中，预先形成的脂质纳米颗粒以不大于0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.25mg/ml、0.2mg/ml、0.15mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，mRNA以不大于0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.25mg/ml、0.2mg/ml、0.15mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，所述预先形成的脂质纳米颗粒和所述mRNA中的每一者以不大于0.5mg/ml、0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.25mg/ml、0.2mg/ml、0.15mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，所述预先形成的脂质纳米颗粒和所述mRNA中的每一者以不大于0.1mg/ml的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，所述预先形成的脂质纳米颗粒和所述mRNA中的每一者以不大于0.05mg/ml的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，根据本专利技术的方法还包括稀释溶液以实现不大于0.5mg/ml的期望浓度的步骤。在一些实施方案中，预先形成的脂质纳米颗粒包含PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质占脂质纳米颗粒中总脂质的小于3％、小于2.5％、小于2％、小于1.5％或小于1％。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质占脂质纳米颗粒中总脂质的0.1％至3％、或0.75％至2.5％、或0.5％至2％。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质占脂质纳米颗粒中总脂质的约1％。在一些实施方案中，包含预先形成的脂质纳米颗粒和mRNA的溶液包含小于10mM的柠檬酸盐。在一些实施方案中，包含预先形成的脂质纳米颗粒和mRNA的溶液包含小于25％的非水性溶剂。在一些实施方案中，根据本专利技术的方法包括以下步骤：将一种或多种溶液加热(即，从热源向溶液施加热量)至高于环境温度的温度(或维持在高于环境温度的温度下)，所述一种或多种溶液是包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的mRNA的混合溶液。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之前加热mRNA溶液和预先形成的脂质纳米颗粒溶液中的一者或两者的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤期间加热以下中的一种或多种：包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液、和包含脂质纳米颗粒包封的mRNA的溶液。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之后加热脂质纳米颗粒包封的mRNA的步骤。在一些实施方案中，一种或多种溶液被加热到的温度(或一种或多种溶液所维持的温度)为或大于约30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。在一些实施方案中，将一种或多种溶液加热到的温度在从约25-70℃、约30-70℃、约35-70℃、约40-70℃、约45-70℃、约50-70℃或约60-70℃的范围内。在一些实施方案中，一种或多种溶液被加热到的高于环境温度的温度为约65℃。在一些实施方案中，根据本专利技术的方法包括将包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的mRNA的混合溶液中的一种或多种维持在环境温度下(即，不从热源向溶液施加热量)。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之前将mRNA溶液和预先形成的脂质纳米颗粒溶液中的一者或两者维持在环境温度的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤期间将以下中的一种或多种维持在环境温度下：包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液、和包含脂质纳米颗粒包封的mRNA的溶液。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之后将脂质纳米颗粒包封的mRNA维持在环境温度下的步骤。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的环境温度为或小于约35℃、30℃、25℃、20℃或16℃。在一些实施方案中，一种或多种溶液所述维持的环境温度在约15-35℃、约15-30℃、约15-25℃、约15-20℃、约20-35℃、约25-35℃、约30-35℃、约20-30℃、约25-30℃或约20-25℃的范围内。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的环境温度为20-25℃。在一些实施方案中，根据本专利技术的方法包括在环境温度下进行以下步骤：将包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液和包含mRNA的溶液混合以形成包封mRNA的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，通过将溶解在乙醇中的脂质与水性溶液混合来形成预先形成的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，脂质含有一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质和一种或多种PEG脂质。在一些实施方案中，脂质还含有一种或多种胆固醇脂质。通过将那些脂质混合而形成预先形成的脂质纳米颗粒。因此，在一些实施方案中，预先形成的脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质和一种或多种PEG脂质。在一些实施方案中，预先形成的脂质纳米颗粒还含有一种或多种胆固醇脂质。在一些实施方案中，所述一种或多种阳离子脂质选自由以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将信使RNA(mRNA)包封在脂质纳米颗粒中的方法，所述方法包括：/n混合包含预先形成的脂质纳米颗粒和mRNA的溶液，使得形成包封mRNA的脂质纳米颗粒，/n其中所述预先形成的脂质纳米颗粒和/或所述mRNA以不大于0.5mg/ml的浓度存在于所述溶液中。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180829 US 62/724,582;20180831 US 62/725,7651.一种将信使RNA(mRNA)包封在脂质纳米颗粒中的方法，所述方法包括：
混合包含预先形成的脂质纳米颗粒和mRNA的溶液，使得形成包封mRNA的脂质纳米颗粒，
其中所述预先形成的脂质纳米颗粒和/或所述mRNA以不大于0.5mg/ml的浓度存在于所述溶液中。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述预先形成的脂质纳米颗粒以不大于0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.25mg/ml、0.2mg/ml、0.15mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml的浓度存在。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述mRNA以不大于0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.25mg/ml、0.2mg/ml、0.15mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、或0.01mg/ml的浓度存在于所述溶液中。


4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预先形成的脂质纳米颗粒和所述mRNA中的每一者以不大于0.1mg/ml的浓度存在于所述溶液中。


5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预先形成的脂质纳米颗粒和所述mRNA中的每一者以不大于0.05mg/ml的浓度存在于所述溶液中。


6.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括稀释所述溶液以达到不大于0.5mg/ml的浓度的步骤。


7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预先形成的脂质纳米颗粒包含PEG修饰的脂质。


8.如权利要求7所述的方法，其中所述PEG修饰的脂质占所述脂质纳米颗粒中的总脂质的小于3％、小于2.5％、小于2％、小于1.5％或小于1％。


9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述PEG修饰的脂质占所述脂质纳米颗粒中的总脂质的0.1％至3％、或0.75％至2.5％、或0.5％至2％。


10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述PEG修饰的脂质占所述脂质纳米颗粒中的总脂质的约1％。


11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含预先形成的脂质纳米颗粒和mRNA的溶液包含小于10mM的柠檬酸盐。


12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含预先形成的脂质纳米颗粒和mRNA的溶液包含小于25％的非水性溶剂。


13.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述混合之后将所述脂质纳米颗粒和所述mRNA加热至高于环境温度的温度。


14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述混合之前将所述mRNA和/或所述预先形成的脂质纳米颗粒加热至高于环境温度的温度。


15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述温度为或大于约30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。


16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述温度在约25-70℃、约30-70℃、约35-70℃、约40-70℃、约45-70℃、约50-70℃或约60-70℃的范围内。


17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述温度为约65℃。


18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预先形成的脂质纳米颗粒通过将溶解在乙醇中的脂质与水性溶液混合而形成。


19.如权利要求18所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·卡夫，Z·帕特尔，Y·张，A·萨罗德，R·L·鲍尔，F·德罗莎，M·哈特莱因，
申请(专利权)人：川斯勒佰尔公司，
类型：发明
国别省市：美国;US