一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因及应用，属于生物技术领域。该假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列全长1446 bp；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码了481个氨基酸残基，可用于制备牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷。本发明专利技术首次在山蚂蝗属植物假地豆中发现一种碳糖基转移酶，具有催化以二羟基柚皮素为底物生成牡荆素、异牡荆素和催化以二羟基柚皮素葡萄糖碳苷为底物生成夏佛塔苷和异夏佛塔苷功能，为在植物体外异源表达牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷提供了高效的生物合成方法。苷提供了高效的生物合成方法。苷提供了高效的生物合成方法。

【技术实现步骤摘要】
一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhC GT1基因及在制备牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷上的应用。

技术介绍

[0002]药用植物假地豆Desmodium heterocarpon(L.)DC.为豆科(Leguminosae)山蚂蝗属(Desmodium)，在国内外均有分布，我国主要分布于云南和广东等地区。假地豆全草入药，具有止痛、清热、利尿、消炎、平肝、解毒、活血、止咳平喘的功效。据《中华本草》记载假地豆对治疗流行性乙型脑炎、肝炎、腮腺炎效果显著。假地豆中主要含有黄酮苷、生物碱、萜类等药用成分，具有较高的药用价值和饲用价值。相关文献报道，夏佛塔苷和异夏佛塔苷是广泛存在于粮食作物和中草药等高等植物中的具有生物活性的天然产物。它们的生物合成可能与植物防御有关。它们对哺乳动物具有多种生物活性，包括抗呼吸道病毒、抗糖尿病、抗高血压、保肝、抗炎和抗氧化活性，这预示着它们作为药物或膳食补充剂的潜在应用。
[0003]目前，针对氧糖基转移酶(OGTs)的研究较为广泛，但对碳糖基转移酶(CGTs)的关注较少。近些年来，黄酮碳苷以其显著的药理活性和不易水解的稳定结构吸引了科研人员对CGTs的广泛关注。目前研究发现CGT基因主要有水稻、玉米、小麦、芒果、葛根、三花龙胆、金橘、蜜柑、石斛、山葵、光果甘草、芦荟、黄芩和金莲花等14种单子叶和双子叶植物中。植物中的大部分CGT能够一步催化2
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羟基黄烷酮发生碳糖基化生成相应黄酮的6位和8位单碳糖苷，如牡荆素、异牡荆素、葛根素、红草苷和异红草苷等。目前只有黄芩中SbCGTb能二步发生糖基化反应生成双碳糖苷夏佛塔苷和异夏佛塔苷。有关药用植物假地豆中黄酮碳苷的生物合成途径中关键酶CGTs的研究还未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因，可作为牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷的生物合成调控基因以及应用于制备牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]本专利技术第一方面提供一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因，该假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列全长1446bp。
[0007]本专利技术第二方面提供上述假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因的编码蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码了481个氨基酸残基。
[0008]本专利技术第三方面提供含有上述假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因中目的基因的重组质粒。
[0009]进一步，优选的是，将假地豆碳糖基转移酶DhCGT1基因与pET28a载体同源重组，获得pET28a
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DhCGT1重组质粒。
[0010]具体地，与载体pET28a进行同源重组时，DhCGT1基因则需要使用用带同源壁的引
ladder DNA Marker(250bp
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I/II的核酸Marke)r；1：重组目的基因；
[0028]图5为DhCGT1的SDS
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PAGE蛋白电泳检测图；其中，M：蛋白质分子质量标准；1为DhCGT1对照试验；2为DhCGT1不经过镍柱纯化的目的蛋白电泳检测；3为经过镍柱纯化的后的DhCGT1蛋白的SDS
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PAGE蛋白电泳检测；箭头为纯化目标蛋白；
[0029]图6为HPLC检测碳糖基转移酶DhCGT1酶活反应产物检测结果；Ⅰ表示4个化合物混合标准品液相分类图；Ⅱ表示酶反应空白对照试验液相检测图；Ⅲ为DhCGT1酶以二羟基柚皮素为底物和以UDP
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glucose为糖供提的酶反应生成黄酮单糖牡荆素和异牡荆素的液相检测图；Ⅳ为DhCGT1以二羟基柚皮素和以UDP
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glucose和UDP
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arabinose 2个糖供提的酶反应生成黄酮双糖夏佛塔苷和异夏佛塔苷；
[0030]图7为LC
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MS检测标准品的结果；其中，Ⅰ为LC
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MS检测混合标准品牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷图谱；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、
Ⅴ
为LC
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MS对标准品分子量提取图谱；a：夏佛碳苷；b：异夏佛碳苷；c：牡荆素；d：异牡荆素；
[0031]图8为LC
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MS检测反应产物结果；其中，Ⅰ为LC
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MS检测DhCGT1以二羟基柚皮素和以UDP
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glucose、UDP
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arabinose 2个糖供提的酶反应生成黄酮单糖和双糖牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷的检测结果；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、
Ⅴ
是对酶反应中提取4个化合物分子量图谱；a：夏佛碳苷；b：异夏佛碳苷；c：牡荆素；d：异牡荆素；
[0032]图9为碳糖基转移酶DhCGT1催化二羟基柚皮素(2
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hydroxynaringenin)的C
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6或者C
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8第一步糖基化反应和第二步的以牡荆素或异牡荆素C
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6和C
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8位上的羟基上的碳糖基化反应步骤；
具体实施方式
[0033]下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。
[0034]本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
[0035]实施例1
[0036]基于假地豆转录组Unigene基本功能注释信息，在测序注释结果中进行筛选CGT候选基因，同时，以金莲花植物中鉴定到的碳糖基基转移酶(TcCGT1)，光果甘草中的碳糖基基转移酶(Ggcgt)的基因为线索，通过序列本地BLAST分析，然后对筛选结果进行整理分析，最后发现11个CGT类型碳糖基基转移酶(T cCGT)。之后进行cDNA的制备、候选基因的扩增及回收、同源重组、蛋白表达、体外酶活反应，以及HPLC及LC/MS检测等一系列工作后，最终鉴定出可以催化二羟基柚皮素C
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6或C
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8位发生碳糖基化反应生成牡荆素或异牡荆素的目标候选碳糖基转移酶DhCGT1基因(图1)。夏佛塔苷和异夏佛塔苷合成二步碳糖基化推测关键反应(图2)，夏佛塔苷和异夏佛塔苷合成的各阶段操作步骤如下：
[0037](1)cDNA模板的制备
[0038]取假地豆的叶鲜样液氮速冻，进行RNA提取。总RNA提取采用Magen(广州美基生物科技有限公司)的HiPure Plant RNA Mini Ki本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因，其特征在于，假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因的编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.含有权利要求1所述的假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因中目的基因的重组质粒。4.根据权利要求3所述的含有假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因中目的基因的重组质粒，其特征在于，将假地豆碳糖基转移酶DhCGT1基因与pET28a载体同源重组，获得pET28a
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DhCGT1重组质粒。5.一种转基因工程菌，含有权利要求1所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的权利要求1所述的碳糖基转移酶DhCGT1基因。6.根据权利要求5所述的转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为大肠杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝冰，袁慧娟，张广辉，杨生超，刘祥宇，谢家伟，陈小巧，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：