一种三角褐指藻中表达外源丙酮酸磷酸双激酶的突变株用于生产岩藻黄质的方法技术

本发明专利技术提供了一种三角褐指藻中表达外源丙酮酸磷酸双激酶的突变株用于生产岩藻黄质的方法，具体涉及对原CyPPDK基因进行藻类偏好性密码子优化，获得新的CyPPDK基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；构建的穿梭表达载体命名为pPha

【技术实现步骤摘要】
一种三角褐指藻中表达外源丙酮酸磷酸双激酶的突变株用于生产岩藻黄质的方法


[0001]本专利技术涉及一种三角褐指藻中表达外源丙酮酸磷酸双激酶过表达突变株用于生产岩藻黄质的方法，属生物工程


技术介绍

[0002]三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)属于硅藻门，羽纹纲，褐指藻目，褐指藻属，是一种重要的水产饵料，富含活性物质如EPA(Eicosapentaenoic Acid)和岩藻黄质(Fucoxanthin)。岩藻黄质也被称为褐藻黄素、岩藻黄素，是胡萝卜素的含氧衍生物，在其分子多烯链上具有一个丙二烯键、一个环氧化物和一个共轭羰基基团，为偏极性类胡萝卜素。岩藻黄质具有多种生物活性，服用岩藻黄质能加快新陈代谢，增加甘油三酯和胆固醇的代谢，具有抗炎、抗肿瘤、抗肥胖和抗氧化等药理作用。而三角褐指藻繁殖速度快，能够在光反应器中培养，细胞中不饱和脂肪酸及岩藻黄质含量高，因此，对三角褐指藻进行改造以提高岩藻黄质、多不饱和脂肪酸的积累量具有重要意义。
[0003]C4植物中含有的C4途径中的相关酶，可促使叶肉细胞将CO2以C4化合物的形式固定下来，使植物在强光、高温、干旱等逆境中，叶片气孔闭合的情况下能够利用有限的水分和低浓度的CO2，保持很高的光合效率。目前，在三角褐指藻中筛选并鉴定出了一系列C4途径的相关基因，其中丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate phosphate dikinase，PPDK)是C4光合途径中一个非常重要的限速酶，可催化丙酮酸和ATP生成磷酸烯醇式丙酮酸。而磷酸烯醇式丙酮酸可结合CO2，因此该步骤为C4光合途径提供重要碳骨架。在植物中，检测到有两种形式的PPDK。一种是定位于叶绿体的PPDK(Chloroplast PPDK，ChPPDK)，另一种是存在于细胞质中的PPDK(Cytoplasmic PPDK，CyPPDK)。CyPPDK一般在植物的非光合组织如根、种子中表达。目前一些研究发现C3植物中的PPDK基因过量表达对一些逆境胁迫产生明显应答，提高了植物对逆境胁迫的耐受性。

技术实现思路

[0004]针对现有三角褐指藻规模化培养中岩藻黄质产量低的问题，本专利技术的目的在于使用遗传转化技术，将外源的C4途径的CyPPDK在三角褐指藻中过表达，通过调控酶活性的磷酸化位点优化，使其酶催化水平提高，促进了细胞碳固定效率，提高了不饱和脂肪酸及岩藻黄质积累量。
[0005]专利技术人通过研究发现，由于三角褐指藻在培养过程中，对于温度极为敏感，而在季节变化过程中，温度的升高极大的影响了三角褐指藻的培养和生产，构建能够耐受较高温度(大于35℃，小于40℃)的突变藻种，对于三角褐指藻的生产具有帮助。因此，本专利首次通过遗传转化技术，将外源海洋微藻中的CyPPDK通过密码子优化及磷酸化位点优化，进一步在三角褐指藻中进行表达，转化突变株显著提高了在高温下的生长速率及EPA和岩藻黄质积累量。
[0006]一种在三角褐指藻中构建过表达丙酮酸磷酸双激酶突变藻株的方法，包括如下步骤：
[0007](1)对原CyPPDK基因进行藻类偏好性密码子优化，获得新的CyPPDK基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
[0008](2)CyPPDK基因过表达载体的构建
[0009]以质粒pPha
‑
T1(图1)为基础表达载体，用fcp
‑
A作为启动子，在fcp
‑
A启动子下游插入上述获得的PPDK基因，构建PPDK表达载体，将质粒pPha
‑
T1作为模板，利用引物pPha
‑
BB
‑
F/R，PCR扩增构建载体所需的骨架片段；利用引物CyPPDK
‑
F/R，以上述获得的PPDK基因为模板，PCR扩增PPDK基因片段；基于PPDK片段与载体骨架片段之间的重叠区域，用无缝连接酶试剂盒进行片段的连接，构建的穿梭表达载体命名为pPha
‑
fcp
‑
PPDK，引物序列如下：
[0010]pPha
‑
BB
‑
F：aaggcgcactaacagaagcgtgctatcgaact SEQ ID NO.1；
[0011]pPha
‑
BB
‑
R：ttttcgcggcatcattcgaaacggcagacaaa SEQ ID NO.2；
[0012]CyPPDK
‑
F：gtttcgaatgatgccgcgaaaagacaagtg SEQ ID NO.3；
[0013]CyPPDK
‑
R：cacgcttctgttagtgcgccttgccattac SEQ ID NO.4。
[0014]序列中的斜体加粗部分表示在载体构建过程中，使用无缝连接酶所需要设计的重叠(over
‑
lap)片段。
[0015](3)转化株的制备
[0016]以步骤(2)构建的表达载体pPha
‑
fcp
‑
PPDK为模板，利用引物Trans
‑
F/R，PCR扩增PPDK基因与抗性基因的线性化片段(图2)，通过电转化的方式导入宿主藻细胞三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)细胞内，筛选转化株，获得过表达丙酮酸磷酸双激酶的三角褐指藻转基因藻株，引物序列如下：
[0017]Trans
‑
F：atttaggtgacactatagaaccaga SEQ ID NO.5
[0018]Trans
‑
R：gcttatcgaaattaatacgactcactataggga SEQ ID NO.6。
[0019]根据本专利技术优选的，步骤(2)中PCR反应体系如下：
[0020]DNA模板0.5μL，上游引物10μM 1μL，下游引物10μM 1μL，KAPA HiFi高保真DNA聚合酶12.5μL，ddH2O 10μL。
[0021]进一步优选的，步骤(2)中PCR反应条件如下：
[0022]95℃预变性5min；98℃变性20s，退火15s，72℃延伸2000bp/min，重复35个循环；72℃延伸5min。
[0023]根据本专利技术优选的，步骤(3)中的PCR反应体系如下：
[0024]DNA模板0.5μL，上游引物10μM 1μL，下游引物10μM 1μL，KAPA HiFi高保真DNA聚合酶25μL，ddH2O 22.5μL。
[0025]进一步优选的，步骤(3)中的PCR反应条件如下：
[0026]95℃预变性5min；98℃变性20s，退火15s，72℃延伸2000bp/min，重复35个循环；72℃延伸5min。
[0027]根据本专利技术优选的，步骤(3)中将宿主藻细胞在f/2液体培养基中培养至对数生长期，离心浓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在三角褐指藻中构建过表达丙酮酸磷酸双激酶突变藻株的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对原CyPPDK基因进行藻类偏好性密码子优化，获得新的CyPPDK基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；(2)CyPPDK基因过表达载体的构建以质粒pPha
‑
T1为基础表达载体，用fcp
‑
A作为启动子，在fcp
‑
A启动子下游插入上述获得的PPDK基因，构建PPDK表达载体，将质粒pPha
‑
T1作为模板，利用引物pPha
‑
BB
‑
F/R，引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，PCR扩增构建载体所需的骨架片段；利用引物CyPPDK
‑
F/R，引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，以上述获得的PPDK基因为模板，PCR扩增PPDK基因片段；基于PPDK片段与载体骨架片段之间的重叠区域，用无缝连接酶试剂盒进行片段的连接，构建的穿梭表达载体命名为pPha
‑
fcp
‑
PPDK；(3)转化株的制备以步骤(2)构建的表达载体pPha
‑
fcp
‑
PPDK为模板，利用引物Trans
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F/R，引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，PCR扩增PPDK基因与抗性基因的线性化片段，通过电转化的方式导入宿主藻细胞三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)细胞内，筛选转化株，获得过表达丙酮酸磷酸双激酶的三角褐指藻转基因藻株。2.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应体系如下：DNA模板0.5μL，上游引物10μM 1μL，下游引物10μM 1μL，KAPA HiFi高保真DNA聚合酶12.5μL，ddH2O 10μL。3.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应条件如下：95℃预变性5min；98℃变性20s，退火15s，72℃延伸2000bp/min，重复35个循环；72℃延伸5min。4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中的PCR反应体系如下：DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：范勇，李福利，姜尔颖，丁晓婷，师晓艺，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：