双功能硫解酶基因MvaE、其表达载体、重组菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双功能硫解酶基因MvaE。本发明专利技术还公开了一种双功能硫解酶、表达盒、重组载体、重组菌或细胞及其应用。本发明专利技术还公开了一种生产脂肪酸的方法。本发明专利技术中双功能硫解酶基因MvaE在兼性厌氧的条件下可利用含葡萄糖、甘油或其它碳源的丰富培养基为原料可提显著高宿主菌中C

【技术实现步骤摘要】
双功能硫解酶基因MvaE、其表达载体、重组菌株及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及双功能硫解酶基因MvaE、其表达载体、重组菌株及其应用。

技术介绍

[0002]脂肪酸是重要的平台化学品，可广泛应用于生物燃料、有机洗涤剂、橡胶复合物、塑料制品、纺织化学品和食品添加剂的合成。传统的脂肪酸获取途径包括直接从动植物细胞提取分离和以石油产品经化学法合成。这些方法存在着效率低、成本高、土地占用率高及环境不友好等缺点。相较于传统方法，脂肪酸的微生物合成法在成本、土地占用率及环保方面具有先天优势，被认为是能够替代传统方法的最具潜力的一种方法。然而目前制约脂肪酸的微生物合成效率的关键技术尚未得到彻底解决。微生物合成脂肪酸的产量及种类与脂肪酸代谢途径的优化及关键酶的催化性质密切相关。
[0003]脂肪酸的生物合成主要由两种代谢途径实现，即通过脂肪酸的正向合成和脂肪酸β
‑
氧化的逆循环实现。一些硫解酶可促使脂肪酸的β
‑
氧化的逆循环，使脂肪酸β
‑
氧化的产物乙酰辅酶A沿脂肪酸的β
‑
氧化途径逆向回流至脂肪酸形成。研究显示，不同类型硫解酶可影响脂肪酸合成的效率和碳链的延伸长度。将内源性硫解酶、脱氢酶以及一系列的外源硫酯酶在大肠杆菌中共表达，可促使脂肪酸β
‑
氧化的逆循环合成不同链长的脂肪酸和脂肪醇，多以短链的形式富集。合成型硫解酶与正向途径脂肪酸合成酶共表达增强β
‑
氧化逆循环中的还原反应，加速脂肪酸合成。脂肪酸的产量受多种因素的影响，其中关键酶的选择以及多种脂肪酸代谢相关基因的协同表达对于脂肪酸合成效率的提高及脂肪酸合成碳链长度的调控起到至关重要的作用。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：为解决现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种双功能硫解酶基因MvaE。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种双功能硫解酶。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体、重组菌或细胞，其含有所述的双功能硫解酶基因MvaE。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供了双功能硫解酶基因MvaE、所述的双功能硫解酶、所述的表达盒、重组载体、重组菌或细胞在脂肪酸合成中的应用。
[0008]本专利技术最后要解决的技术问题是提供了一种生产脂肪酸的方法。
[0009]技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种双功能硫解酶基因MvaE，所述双功能硫解酶基因MvaE的核苷酸序列为：
[0010]i)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或
[0011]ii)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或
[0012]iii)与i)、ii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。
[0013]本
技术实现思路
还包括一种双功能硫解酶，所述双功能硫解酶其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0014]本
技术实现思路
还包括表达盒、重组载体、重组菌或细胞，其含有所述的双功能硫解酶基因MvaE。
[0015]其中，所述重组载体是将的双功能硫解酶基因MvaE导入载体质粒pSTV28获得。
[0016]其中，所述重组菌是将双功能硫解酶基因MvaE导入宿主菌，筛选鉴定后保留阳性菌株，即为含有可表达的MvaE的重组菌株。
[0017]其中，所述宿主菌包括但不仅限于为大肠杆菌MG1655。
[0018]本
技术实现思路
还包括所述的双功能硫解酶基因MvaE、所述的双功能硫解酶、所述的表达盒、重组载体、重组菌或细胞在脂肪酸合成中的应用。
[0019]本
技术实现思路
还包括一种生产脂肪酸的方法，将所述的重组菌接种到发酵培养基中进行发酵培养获得。
[0020]其中，所述发酵温度为25
‑
38℃；所述发酵体系的初始pH值为6.5
‑
7.5；发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖和淀粉中的一种或几种；发酵培养基中的氮源为酵母粉、蛋白胨、氨水、铵盐和尿素中的一种或几种。
[0021]其中，所述发酵培养基包括甘油、蛋白胨、酵母粉及氯化钠溶解于pH7.0
‑
7.5的MOPS缓冲液中即得。
[0022]本专利技术所述的重组菌能够过表达双功能硫解酶基因MvaE，从而可显著提高宿主菌中C
14：0
，C
16：0
和C
18：0
脂肪酸含量。
[0023]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术中过表达的人工设计的双功能硫解酶基因MvaE在兼性厌氧的条件下可利用含葡萄糖、甘油或其它碳源的丰富培养基为原料可提显著高宿主菌中C
14：0
，C
16：0
和C
18：0
脂肪酸含量，其增加幅度根据不同宿主菌株从27％到213％不等。
附图说明
[0024]图1为MvaE对大肠杆菌MG1655菌落形态的影响；
[0025]图2为Anthony氏荚膜染色实验；
[0026]图3为苏丹黑染色实验。
具体实施方式
[0027]下面将结合以大肠杆菌为宿主菌的实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0028]实施例1：基于大肠杆菌密码子偏好性进行的双功能硫解酶基因MvaE的人工设计和合成
[0029]根据SEQ ID NO：1所示的MvaE基因的DNA序列对MvaE基因密码子进行优化以利于其在大肠杆菌中表达。优化后的核酸序列添加核糖体结合位点序列后如SEQ NO：2所示。该
密码子优化后的基因序列有生工生物工程(上海)股份有限公司合成，合成的基因序列的5
’
和3
’
末端分别带有BamH I和Hind III酶切位点。
[0030]实施例2：用于大肠杆表达MvaE基因的表达载体pSTmvaE的构建
[0031]将有如SEQ NO：2的DNA序列构建于表达载体上，如pSTV28载体。具体实施步骤如下：
[0032]将实施例1合成DNA片段及载体质粒pSTV28分别用BamH I和Hind III进行双酶切；琼脂糖电泳回收酶切DNA片段及载体大片段，通过DNA连接酶将酶切后的基因片段依次于16℃连接于pSTV28的对应酶切产物形成pSTmvaE。用每次的连接反应产物转化大肠杆菌MG1655，然后涂于含30μg/mL Cmp(氯霉素)的培养皿，37℃培养10
‑
12h。次日挑取单菌落采用上海生工质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双功能硫解酶基因MvaE，其特征在于，所述双功能硫解酶基因MvaE的核苷酸序列为：I）SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或ii）SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或iii）与i）、ii）的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。2.一种双功能硫解酶，其特征在于，所述双功能硫解酶其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.表达盒、重组载体、重组菌或细胞，其含有权利要求1所述的双功能硫解酶基因MvaE。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将的双功能硫解酶基因MvaE导入载体质粒pSTV28获得。5.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：周佳，田宝霞，李相前，
申请(专利权)人：淮阴工学院，
类型：发明
国别省市：