来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因RS及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因RS及其应用，该白藜芦醇合酶基因RS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术以三叶青作为生物来源设计引物对其cDNA序列进行扩增，得到了白藜芦醇合酶基因RS，该基因作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。藜芦醇。藜芦醇。

【技术实现步骤摘要】
来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因RS及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，主要涉及一种来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因 RS及其应用。

技术介绍

[0002]随着近几年国家对中医药的高度重视，政府的大力扶持，带动了中药产业的快速发展，扩大了三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的市场需求。对三叶青抗肿瘤作用研究的不断深入，导致近年来三叶青市场价格突飞猛进，其市场需求也越来越大。
[0003]近年来，药用植物次生代谢产物合成的基因调控已成为分子生物学十分活跃的前沿研究领域，代谢产物的量和组成主要取决于生物合成关键酶以及在细胞中的表达水平。而目前三叶青的研究主要集中在种植栽培、种苗培育、化学成分的提取分离和药理药效作用等方面，对其分子水平上的研究比较少。
[0004]白藜芦醇作为因“法国悖论”而闻名的红酒中的天然成分，大量科学研究证明其具有靶向多靶点、发挥多种有益健康和治疗疾病的作用，具有极大的研究价值。白藜芦醇在植物中主要通过苯丙烷代谢途径产生，该途径以苯丙氨酸为底物，苯丙氨酸被苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)催化生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)的作用下催化形成香豆酸，香豆酸又在4-香豆酸-辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase,4CL)的作用下形成4-香豆酰辅酶A(4-coumarate-CoA ligase,4CA)，最后白藜芦醇合酶(resveratrol synthase, RS)催化1分子的4CA和3分子的丙二酰辅酶A(malonly-CoA，COA)合成白藜芦醇。
[0005]目前，三叶青的全基因组还未公布，有必要通过挖掘三叶青白藜芦醇生物合成的关键酶基因，试图揭示这些关键酶基因在其生物合成途径中的表达调控情况，并希冀以此为基础获得高产量白藜芦醇。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因RS及其应用，该白藜芦醇合酶基因RS来源于三叶青，作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。
[0007]具体技术方案如下：
[0008]本专利技术提供了一种白藜芦醇合酶基因RS，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
[0009]本专利技术提供了一种包含所述的白藜芦醇合酶基因RS的重组表达载体。
[0010]作为优选，表达载体为pMD19-T载体。
[0011]本专利技术还提供了一种包含所述白藜芦醇合酶基因RS的基因工程菌。
[0012]所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌DH5α。
[0013]本专利技术还提供了一种白藜芦醇合酶，所述白藜芦醇合酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
[0014]作为优选，所述白藜芦醇合酶由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的白藜芦醇合酶基因RS编码获得。
[0015]本专利技术提供了所述的基因工程菌在生产白藜芦醇中的应用。
[0016]本专利技术提供了所述的白藜芦醇合酶在生产白藜芦醇中的应用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0018]本专利技术以三叶青作为生物来源设计引物对其cDNA序列进行扩增，得到了白藜芦醇合酶基因RS，该基因作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。
附图说明
[0019]图1为三叶青白藜芦醇合酶基因RS的PCR电泳图。
[0020]图2为白藜芦醇合酶RS的二级结构预测；
[0021]α-螺旋：最长的竖直线；延伸链：第二长竖直线；β-转角：第三长竖直线；无规则卷曲：最短竖直线。
[0022]图3为白藜芦醇合酶RS的三维结构预测。
[0023]图4为白藜芦醇合酶RS氨基酸序列的系统进化树分析。
具体实施方式
[0024]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述，以下列举的仅是本专利技术的具体实施例，但本专利技术的保护范围不仅限于此。
[0025]实施例1三叶青ThRS基因cDNA全长序列的获得
[0026]取三叶青新鲜植株的叶片，用锡箔纸包好，并用液氮迅速冷冻，提取总RNA，并反转录成cDNA。总RNA的提取按照TIANGEN RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(DP441)说明书进行，经1.0％琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度检测仪检测其完整性及浓度。
[0027]总RNA的反转录按照Takara PrimeScript
TM
II 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。
[0028]根据已有的转录组数据与NCBI中同科属的RS基因序列进行BLAST分析，选取相似度最高的序列为目的基因序列，以此序列的开放阅读框序列为模板设计了多对引物，其中两对扩增引物为(RS-F1：5
’-
ATGACTGAGTTGAAGAAG-3
’
，RS-R1：5
’-
TT AAGTTGAGATTGTAGG-3
’
；RS-F2：5
’-
ATGACTGAGTTGAAGAAGAAG-3
’
，RS-R2： 5
’-
TTAAGTTGAGATTGTAGGAAC-3
’
)。
[0029]以三叶青cDNA为模板，利用Premix Taq(Ex Taq Version 2.0plus dye)进行P CR扩增，PCR基因扩增的总反应体系为50μL：25μL Premix Taq、2.5μL Templa te cDNA、1μL Forward primer、1μL Reverse primer和22μL RNase Free dH2O。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，结果表明RS-F1与RS-R1为可用引物，其退火温度为49℃，结果如图1所示。
[0030]将扩增产物用Tiangen TIANgel Midi Purification Kit(DP190123)试剂盒进行切胶回收，随后将回收产物连接到pMD19-T载体上并16℃孵育过夜，其连接体系为：0. 5μL pMD19-T Vector、4.5μL回收产物和5.0μL SolutionⅠ。取5μL连接产物加入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，42℃热激60s，迅速放入冰中冰浴2min，加入700μL LB培养基，于37℃摇床内200rpm震荡摇菌1 h，在超净台中吸取200μL涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基板上，于37℃培养箱中培养12h，挑取单克隆于LB液体培养基(含
GACTGAGTTGAAGAAG；下游引物：GCTCTAGATTAAGTTGAGATTGTAGG)，用于构建过表达载体。
[0041]以三叶青cDNA为模板进行P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白藜芦醇合酶基因RS，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种包含权利要求1所述的白藜芦醇合酶基因RS的重组表达载体。3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，表达载体为pMD19-T载体。4.一种包含权利要求1所述的白藜芦醇合酶基因RS的基因工程菌。5.一种白藜芦醇合酶，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏鹏国，张宇，胡婉莹，郑宇婕，侯卓妮，梁宗锁，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：