一种坛紫菜谷草转氨酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体的说是一种坛紫菜谷草转氨酶基因及其应用。谷草转氨酶(GOT)基因为序列表SED IQ No.1中的碱基所示。本发明专利技术基于坛紫菜转录组测序结果，从坛紫菜中克隆得到一种转录水平较高的谷草转氨酶(GOT)基因的cDNA序列，其开放阅读框(ORF)为1290bp，编码含429个氨基酸的蛋白质序列。利用体外原核表达体系，成功获得可溶性重组蛋白表达。达。

【技术实现步骤摘要】
一种坛紫菜谷草转氨酶基因及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体的说是一种坛紫菜谷草转氨酶基因及其应用。

技术介绍

[0002]谷氨酸和天冬氨酸是坛紫菜中重要的呈味氨基酸，谷草转氨酶(GOT)是两者合成代谢途径中的关键酶，它存在于几乎所有真核生物体内，是生物体内众多转氨酶中很重要的一个，可催化L-谷氨酸(Glu)和草酰乙酸(OAA)生成酮戊二酸(KG)和L-天冬氨酸(ASP)，在三羧酸循环和糖异生代谢中起着重要的作用，是生物体内氨基酸的生物合成和降解的重要中间介质；除此之外，谷草转氨酶还参与了体内VB6的代谢过程，并且对植物体的固氮作用有一定影响。
[0003]在体外，谷草转氨酶能够以酸性氨基酸为氨基供体,T-酮酸为氨基受体,专一性地制备一系列芳香族氨基酸，可用于芳香族氨基酸的生产。
[0004]但目前对植物体内的谷草转氨酶的活性研究较少，通过体外表达系统可对坛紫菜中的谷草转氨酶的催化活性进行进一步的研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供一种坛紫菜谷草转氨酶基因及其应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：
[0007]一种坛紫菜谷草转氨酶基因，谷草转氨酶(GOT)基因为序列表SEDIQ No.1中的碱基所示。
[0008]所述基因所编码的蛋白为序列表SEDIQ No.2中氨基酸所示。
[0009]一种坛紫菜谷草转氨酶基因，所述基因所编码的蛋白在合成天冬氨酸中的应用。
[0010]一种坛紫菜谷氨酸合成酶基因的重组质粒，所述重组质粒含所述的谷草转氨酶(GOT)基因所编码的蛋白。
[0011]一种坛紫菜谷草转氨酶基因的重组质粒的应用，所述质粒在合成天冬氨酸中的应用。
[0012]本专利技术的突出优点如下：
[0013]本专利技术从坛紫菜中克隆获得谷草转氨酶基因，并通过体外原核表达技术获得该基因开放阅读框(ORF)全长序列，对其编码蛋白质的特征进行在线预测分析；通过低温诱导表达，得到GOT蛋白，通过SDS-PAGE及Western blot检测目的蛋白的可溶性。
[0014]本专利技术所得坛紫菜GOT蛋白可在原核表达系统中得到可溶性表达；且序列中经检测发现含有Aminotran_1_2结构域，属于转氨酶家族。
附图说明
[0015]图1为本专利技术是实例提供的GOT基因克隆电泳图与western blot结果图；其中，
a.GOT基因扩增；b.western blot检测结果。
具体实施方式
[0016]以下结合实例对本专利技术的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本专利技术，并不局限于本专利技术。
[0017]本专利技术基于坛紫菜转录组测序结果，从坛紫菜中克隆得到一种转录水平较高的谷草转氨酶(GOT)基因的cDNA序列，其开放阅读框(ORF)为1290bp，编码含429个氨基酸的蛋白质序列。利用体外原核表达体系，成功获得可溶性重组蛋白表达。
[0018]实施例1
[0019]本专利技术所述坛紫菜GOT基因的克隆方法，主要包括以下步骤：
[0020]1.坛紫菜叶状体总RNA提取及cDNA合成；
[0021]2.GOT基因特异性引物合成及PCR扩增产物测序；
[0022]3.GOT蛋白质结构预测分析。
[0023]具体操作如下：
[0024]1.坛紫菜叶状体总RNA的提取：取适量坛紫菜样品(≤100mg)，于液氮预冷的研钵内研磨，重复3～5次，取研磨好的粉末进行RNA提取。按照OMEGA公司的植物RNA提取试剂盒(Plant RNA Kit)步骤提取海带总RNA。利用Roche公司的Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit合成试剂盒反转录合成cDNA，用于基因扩增。详细操作参见各试剂盒说明书。
[0025]2.GOT基因特异性引物合成及PCR扩增产物测序：在坛紫菜转录数据基础上，利用Primer Premier 5软件，设计扩增GOT基因ORF的特异性引物序列GOT-F和GOT-R(表1)。扩增体系为：0.5μl cDNA，1μl GOT-F，1μl GOT-R，10μl TAKARA PrimerSTAR，7.5μl ddH2O。反应程序为：98℃预变性5min；然后进入35个循环：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1.5min；最后进行72℃延伸10min。PCR产物经DNA电泳检测、胶回收、连接与转化后，测序验证。
[0026]3.GOT蛋白质结构分析：对获得的目的SEDIQ No.1所示的GOI基因序列，用ORF finder工具测其开放阅读框，并将核酸序列翻译为氨基酸序列如SEDIQ No.2所示。用ProtParam在线工具测蛋白的分子量(MW)和等电点(pI)，同时用SignalP 4.1预测蛋白的信号肽序列，用TMHMM Server v.2.0预测蛋白是否含有跨膜结构。经测，GOT基因ORF全长1290bp，编码429个氨基酸序列，编码蛋白分子量MW为45.04kDa，理论等电点为7.11，是一种胞内蛋白。
[0027]表1引物及其核苷酸序列
[0028]引物名称引物序列(5
’-3’
)GOT-FCCCAAGCTTATGACGACCACGGCGATGGCGCCGGGOT-RCCGGAATTCTTACTCCTGTTTGACGACGGTTTCC
[0029]SEDIQ No.1坛紫菜谷草转氨酶(GOT)基因碱基序列ATGACGACCACGGCGATGGCGCCGGCCAAGGCGATGACGAGCGTCTTTGCGAGCGTGCCCGAGGCGCCTGCGGATCCCATCCTGGGCCTTAACGCAGCCTTCCTGGCAGACGAGGCGCCGGAAAAGATCAGCCTGGGCGTCGGTGCGTTCCGCACGAATGAGGGCAAGCCGTACGTGCTGCCGGTGGTCAAGCGCGTGGAGCAGCGGCTGGCGGCGGATCCCGCCACCAACCACGAGTACCTGCCCATTGATGGCC
TGCCTGCCTTTCAAAAGCTGAGCGCGGAGCTCATCCTCGGCAAGGACAGCACGGCCATGAAGGAGGGTCGCGTGGTCACGATTCAAGCCCTGTCGGGGACGGGTGCCCTGCGGGTGGGTATTACCTTCCTTGGGCGGTTCCTCCGCACGTCGGGTTCGCCACCCGCCGTGTACATCCCGACGCCGACCTGGTCCAACCACCGCAACATTGTGCCCGACGCGGGCCTCGGTTCAGCCCGTACGTACCGCTACCTGGACGCGGTGAGCGGAGGGGTGGACCTACCGAGCATGCTCGCAGACCTGTCGGACGCGCCCGCGGGGTCCGTCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种坛紫菜谷草转氨酶基因，其特征在于：谷草转氨酶(GOT)基因为序列表SEDIQ No.1中的碱基所示。2.按权利要求1所述的坛紫菜谷草转氨酶基因，其特征在于：所述基因所编码的蛋白为序列表SEDIQ No.2中氨基酸所示。3.一种权利要求1所述的坛紫菜谷草转氨酶基因，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：段德麟，李爽，邵展茹，姚建亭，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：