糖基转移酶基因的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种糖基转移酶基因的用途，即糖基转移酶基因在提高植物乳杆菌胞外多糖合成中的应用；糖基转移酶基因为基因orf1595或基因cps4I，基因orf1595的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因cps4I的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；将orf1595或cps4I基因与温度敏感型质粒重组构建敲除载体，并导入食源性植物乳杆菌感受态细胞中，进而通过同源重组构建基因敲除菌株；采用苯酚

【技术实现步骤摘要】
糖基转移酶基因的用途


[0001]本专利技术属于微生物基因的功能与应用领域，具体涉及糖基转移酶基因orf1595、cps4I在提高植物乳杆菌YM 4-3胞外多糖生物合成中的应用。

技术介绍

[0002]乳酸菌（Lactic Acid Bacteria）是一类公认安全（generally regarded as safe, GRAS）发酵葡萄糖或者用乳糖产生乳酸的微生物的统称。不仅存在于无机环境当中，而且在人类、动物肠道等环境中亦很常见，传统上与发酵食品相关，并且与人类文化和福祉密切相连，在历史上，乳酸菌因其对所发酵食品感官、质量和安全方面所具有的积极贡献而广为人知。
[0003]乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是乳酸菌所产生的一种重要次级代谢产物，近年来引起了人们广泛关注和认识。微生物 EPS 是一种高分子量、长链、线性或支链生物聚合物，经常由重复的糖单元或由 α-和 β-糖苷键连接的糖衍生物组成，它是微生物在生长过程中分泌到细胞外的一种代谢产物，可以分为粘附于细胞表面的荚膜多糖和游离于培养基中的粘液多糖两种类型，它对微生物不仅具有保护和粘附作用往往还具有其他一些对人类或植物或动物有益的特性。例如乳酸菌所产胞外多糖在帮助微生物抵御脱水、营养缺乏、噬菌体、渗透压、拮抗物和有毒物等不利条件时发挥重要作用。微生物源胞外多糖相较于植物源多糖以及动物源多糖而言，其易培养、不受病虫害影响、环境季节限制因素较少、可大规模培养发酵以及生理活性多种多样等特性赋予了微生物胞外多糖更优秀的应用潜质。多样的可培养微生物的存在为人类生产生活提供了巨大的便利，其代谢产物可应用于农业、制药、化妆品、食品等行业，并且丰富了人们的生活。
[0004]随经济发展而来的是人类健康的需求不断升高，乳酸菌EPS安全的来源及其多样的生理活性使其在市场上更具有竞争力。但是通常情况下EPS合成量普遍不高，且菌株稳定性较差，提取和纯化成本高等因素制约着乳酸菌EPS在工业生产中大规模的应用，因此将愈加成熟的基因工程技术对相应菌株基因层面的改造结合最优的培养条件能有效提高EPS合成量并降低成本，并使得EPS的工业化生产成为可能。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种糖基转移酶基因的用途，即糖基转移酶基因orf1595或cps4I在提高植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）胞外多糖合成中的用途，所述基因orf1595的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，基因cps4I的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；本专利技术将orf1595、cps4I基因与温度敏感型质粒pFED760重组构建了敲除载体pFED760-Δorf1595、pFED760-Δcps4I，并将其导入植物乳杆菌感受态进而通过同源重组构建了orf1595、cps4I基因单敲除菌株Δorf1595、Δcps4I；通过比较野生型菌株与敲除菌株的生理生化差异以及EPS产量的不同证明orf1595或cps4I基因在EPS合成中起关键作用，本专利技术在EPS生物合成的研究及应用领域具有很大潜力。
[0006]为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术的技术方案如下：1、糖基转移酶基因orf1595、cps4I敲除载体的制备，所述敲除载体通过以下方法得到：以食源性植物乳杆菌基因组为模板，利用引物对（orf1595-up-F+ orf1595-up-R；orf1595-down-F+ orf1595-down-R；cps4I-up-F + cps4I-up-R；cps4I-down-F + cps4I-down-R）分别扩增上下游同源臂，PCR产物用作模板，利用引物对（orf1595-up-F + orf1595-down-R；cps4I-up-F + cps4I-down-R）扩增得到敲除片段，该片段纯化后，与温度敏感型质粒pFED760分别用限制性内切酶EcoRⅠ、Hind
ꢀⅢ
同步酶切，酶切产物经切胶回收后，进行连接实验，连接产物导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒得到orf1595、cps4I基因敲除载体pFED760-Δorf1595、pFED760-Δcps4I，其中引物序列如下：orf1595-up-F
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CCGGAATTCGATGGATCTAAAGCGGTGTT-3
’
，orf1595-up-R
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CGCTGAATGAATTGCCTTTGTGCCGCATGTATTTGTAAGG-3
’
；orf1595-down-F
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CCTTACAAATACATGCGGCACAAAGGCAATTCATTCAGCG-3
’
，orf1595-down-R
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CCCAAGCTTGTGGCAAGCCGTCAACGA-3
’
；cps4I-up-F
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CCGGAATTCGACAAGTGAAACGGTCTT-3
’
，cps4I-up-R
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5’-ꢀ
TCTGCTCCCGTCCGTTTACGCTCCCTCGGCAAATAGGTT-3
’
；cps4I-down-F
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AACCTATTTGCCGAGGGAGCGTAAACGGACGGGAGCAGA-3
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，cps4I-down-R
ꢀꢀꢀꢀ5’-ꢀ
CCCAAGCTTAGGTCCATACCATTAGAAGC-3
’
；本专利技术中orf1595、cps4I基因及其上下游同源臂序列如SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4所示，来源于食源性植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；植物乳杆菌因其安全无害等特点，广泛应用于食品、药品等领域，故其基因也是对人体安全无害的，这将为该专利技术将来在胞外多糖生产领域的应用提供理论的安全保障。
[0007]2、糖基转移酶基因orf1595、cps4I敲除菌株构建和筛选，包括上述糖基转移酶基因orf1595、cps4I敲除载体构建及后期敲除载体转化和敲除菌株筛选，步骤如下：（1）敲除载体pFED760-Δorf1595、pFED760-Δcps4I的转化：在90~100μL植物乳杆菌感受态中分别加入10μL敲除载体pFED760-Δorf1595、pFED760-Δcps4I轻轻混匀，冰浴5min后转入预冷电击杯中，按照1.25 kv/cm，200 Ω的参数进行电击，电击完成后迅速向电转杯中加入900μL新鲜MRS培养液，用枪头轻轻吹打混匀后，将混合液转移至无菌1.5mL离心管中，28℃静止培养2.5~3h使细胞复苏。培养后菌液8000~10000 rpm离心3 min，弃900μL上清液，用剩余上清液重悬菌体，涂布于含有50μg/mL红霉素MRS固体平板上，28℃静本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.糖基转移酶基因在提高植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）胞外多糖合成中的应用，所述糖基转移酶基因为基因orf1595或基...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨恩，熊永刚，柳陈坚，罗义勇，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：