菊花花青苷转运基因CmGST1及其应用制造技术

本发明专利技术提供菊花花青苷转运基因CmGST1及其应用。该基因核酸序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供的菊花花青苷转运基因CmGST1具有花青苷转运功能，CmGST1的基因表达在菊花花瓣发育过程中呈上调趋势，与菊花花色表型以及花青苷含量呈显著正相关。将CmGST1与转录因子CmMYB6和CmbHLH2瞬时过量表达到烟草叶片中，发现CmGST1可显著增强花青苷的积累，CmGST1是编码花青苷转运蛋白的功能结构基因，可在在植物颜色修饰基因工程中应用。色修饰基因工程中应用。

【技术实现步骤摘要】
菊花花青苷转运基因CmGST1及其应用


[0001]本专利技术属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及菊花花青苷转运基因CmGST1及其应用。

技术介绍

[0002]菊花作为世界四大切花之一，因品种繁多、花色变异度丰富成为鲜切花市场中重要的组成部分。花色作为菊花最重要的观赏性状之一，成为了广大遗传育种工作者改良的目标。
[0003]目前针对菊花的研究主要集中在类胡萝卜素和花青苷两种色素，其中类胡萝卜素主要集中在黄色品种，而花青苷则分布范围广泛，从红色到紫色品种均有花青苷的积累。因此花青苷呈色机理的研究成为遗传育种过程中必不可少的基础。根据前人的研究，花青苷合成途径属于苯丙烷代谢途径的一个分支，主要以丙二酰辅酶A和香豆素辅酶A为底物，经过一系列酶促反应，最终合成三种不同类型的花青素，分别为橙红色至红色的天竺葵素、红色至紫色的矢车菊素和蓝色系的飞燕草素。
[0004]花青苷在细胞的内质网膜上合成，而储存于细胞的液泡内，因此花青苷的转运进程尤为重要。相较于研究较为清晰的合成通路，花青苷的转运机制却依旧存在很多猜想。根据前人对于花青苷囊泡运输的显微镜观察实验，花青苷跨膜运输主要包括谷胱甘肽转移酶家族基因(GST)和多药耐药相关蛋白家族(MATE)。已经鉴定出来的GST家族包括玉米Bz2，矮牵牛AN9，拟南芥TT19等，而MATE家族主要包括葡萄anthoMATE等。针对GST家族蛋白的转运方式，目前的研究也有诸多争议，一种转运途径认为GST家族和多药耐药相关蛋白家族(MRP/ABCC)共同介导的转运方式，认为GST催化还原型谷胱甘肽(GSH)与花青苷形成交联复合物，随后被MRP蛋白转运至液泡膜，如玉米Bz2；第二种转运途径认为GST直接与类黄酮结合将花青苷转运到液泡中，如矮牵牛AN9,拟南芥TT19等。在菊花中，花青苷转运相关基因尚未被筛选和鉴定。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一个菊花花青苷转运基因CmGST1，所述基因的核酸序列序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]本专利技术的另一目的是提供所述菊花花青苷转运基因CmGST1在植物颜色修饰基因工程中中的应用。本专利技术所述菊花花青苷转运基因CmGST1具有花青苷和还原性谷胱甘肽(GSH)底物结合位点，具有增强花青苷积累的功能，可应用于修饰植物色泽。
[0007]本专利技术的应用通过以下技术方案实现：一种分离自菊花
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蒙娜丽莎粉
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中的具有花青苷转运功能的谷胱甘肽转移酶家族基因CmGST1，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA全长序列为642bp，包含642bp的开放阅读框。CmGST1所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码213个氨基酸，具有花青苷和还原性谷胱甘肽(GSH)底物结合位点。
[0008]将CmGST1搭载到植物双元表达载体上，与花青苷激活因子CmMYB6和CmbHLH2瞬时过量表达到烟草叶片中，可获得花青苷积累明显增强的叶片。
[0009]本专利技术以粉色切花菊
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蒙娜丽莎粉
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为试材，应用RACE、实时定量PCR和瞬时表达等生物学技术，分离鉴定出参与菊花花青苷转运的CmGST1(SEQ ID NO.1)。研究发现，随着
‘
蒙娜丽莎粉
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花瓣中花青苷的积累，CmGST1表达上调，与其呈良好正向相关，烟草瞬时过表达结果证明CmGST1确实具有增强花青苷积累的功能。本专利技术利用RACE、实时定量PCR、双荧光素酶系统技术和烟草瞬时表达技术，分离并鉴定出菊花CmGST1(SEQ ID NO.1)对花青苷积累具有显著增强作用，可应用到植物颜色修饰的基因工程中。
附图说明
[0010]图1为4个CmGST基因在
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蒙娜丽莎白
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和
‘
蒙娜丽莎粉
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的不同发育阶段中表达模式分析。
[0011]图2为
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紫丹特
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菊花不同发育阶段中CmGST1表达模式分析。
[0012]图3为菊花CmGST1亚细胞定位。
[0013]图4中A.菊花CmGST1瞬时表达烟草叶片；B.烟草叶片花青苷含量测定。
具体实施方式
[0014]下面结合附图和实施例，以菊花CmGST1(SEQ ID NO.1)、CmGST2(SEQ ID NO.7)、CmGST3(SEQ ID NO.8)、CmGST4(SEQ ID NO.9)为例对本专利技术做进一步阐述，但实施例不限制本专利技术的保护范围。
[0015]在下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》(第三版)。
[0016]实施例1：菊花CmGST基因表达模式分析
[0017](一)实验方法
[0018]利用Primer Premier 5，依据菊花RNA
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Seq数据库中CmGST1(SEQ ID NO.1)、CmGST2(SEQ ID NO.3)、CmGST3(SEQ ID NO.4)、CmGST4(SEQ ID NO.5)的序列分别设计实时定量PCR(QPCR)引物组合SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13。以菊花actin基因(SEQ ID NO.14)的表达量为内参分析各个GST基因表达模式，其QPCR引物组合为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。所有QPCR引物特异性经熔点曲线分析、凝胶电泳分析和QPCR产物再测序验证。
[0019]利用CTAB法分别提取
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蒙娜丽莎白
’
和
‘
蒙娜丽莎粉
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花瓣三个发育阶段的舌状花、管状花以及嫩叶的总RNA，以及
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紫丹特
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和
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悦粉
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花瓣的五个发育阶段总RNA。参照cDNA合成kit(Bio
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Rad，USA)说明书，逆转录合成cDNA。参照Ssofast EvaGreen Supermix kit(Bio
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Rad，USA)说明书开展QPCR分析，采用20μL体系：其中10μL 2
×
Ssofast EvaGreen Supermix(Bio
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Rad，USA)，1.0μL上游引物(10μM)，1.0μL下游引物(10μM)，2.0μL稀释的cDNA和6.0μL H2O。QPCR程序为：94℃，10min；45个循环的94℃10s和60℃30s。
[0020](二)实验结果
[0021]基因表达分析结果说明，CmGST1(SEQ ID NO.1)基因表达在菊花
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蒙娜丽莎白
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一个菊花花青苷转运基因CmGST1，其特征在于，所述基因的核酸序列序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：李方，李亚静，刘晓芬，向理理，陈昆松，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：