表达端粒酶的基因、重组质粒、重组细胞及应用制造技术

技术编号:28492447 阅读:17 留言:0更新日期:2021-05-19 22:18
本发明专利技术提供了表达端粒酶的基因、重组质粒、重组细胞及应用,属于基因工程技术领域;所述基因包括第一基因或第二基因,所述第一基因表达第一端粒酶;所述第二基因表达第二端粒酶;所述第一端粒酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述第二端粒酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术所述第一端粒酶来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis);所述第二端粒酶来源于白色念珠菌(Canidia albicans)。本发明专利技术表达端粒酶的基因能够在大肠杆菌、酵母菌和Sf9细胞中大量表达,且表达得到的端粒酶具有生物活性。有生物活性。有生物活性。

【技术实现步骤摘要】
表达端粒酶的基因、重组质粒、重组细胞及应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
,尤其涉及表达端粒酶的基因、重组质粒、重组细胞及应用。

技术介绍

[0002]端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA

蛋白质复合体,作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期。端粒的长度反映了细胞复制史及复制潜能。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用,端粒酶能延长缩短的端粒(缩短的端粒其细胞复制能力受限),从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。现有技术公开了在酵母中表达酵母端粒酶的技术方案,但是这一方法获得酵母端粒酶的过程存在产量低的技术问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供表达端粒酶的基因、重组质粒、重组细胞及应用,利用本专利技术的重组细胞制备端粒酶,具有产量高的优势。
[0004]为了实现上述专利技术目的,本专利技术提供以下技术方案:
[0005]本专利技术提供了表达端粒酶的基因,所述基因包括第一基因或第二基因,所述第一基因表达第一端粒酶;所述第二基因表达第二端粒酶;所述第一端粒酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述第二端粒酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006]优选的,所述第一基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述第二基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]本专利技术提供了一种包括上述方案所述基因的重组质粒。
[0008]优选的,所述重组质粒的构建用骨架质粒包括pET15b

sμmo、pPICZA、pPICZaA或pTrix。
[0009]本专利技术提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组细胞。
[0010]优选的,当所述重组质粒的构建用骨架质粒为pET15b

sμmo时,所述重组细胞的原始细胞包括大肠杆菌;当所述重组质粒的构建用骨架质粒为pPICZA或pPICZaA时,所述重组细胞的原始细胞包括酵母菌;当所述重组质粒的构建用骨架质粒为pTrix时,所述重组细胞的原始细胞包括Sf9细胞。
[0011]本专利技术提供了上述方案所述的基因或者所述的重组质粒或者所述的重组细胞在制备端粒酶中的应用。
[0012]优选的,当所述重组细胞的原始细胞为大肠杆菌时,所述应用包括以下步骤:
[0013]1)对所述重组细胞依次进行活化培养和扩大培养,得到菌液;所述菌液的OD
600
值为0.5~0.7;所述活化培养和扩大培养的培养基分别包括包含有氨苄的LB液体培养基;所述LB液体培养基中氨苄的浓度为80~120μg/mL;
[0014]2)在所述菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷至异丙基硫代半乳糖苷的摩尔浓度为0.2~0.4mM,于100~200rpm、15~20℃的条件下诱导端粒酶表达12~18h,得到诱导液;
[0015]3)对所述诱导液进行离心,收集沉淀;采用咪唑水溶液溶解所述沉淀,得到溶解液;所述咪唑水溶液的体积和所述沉淀的质量的比例为8~12mL:1g;
[0016]4)将所述溶解液于800~1200bar的条件下高压破碎、再于300~500W的条件下超声破碎,得到破碎液;
[0017]5)将所述破碎液于10000~15000rpm条件下离心30~50min,收集上清液,采用0.45μm滤头对所述上清液进行过滤,收集第一滤液;将所述第一滤液加样至NI层析柱,洗脱液洗脱流出液,收集第三个峰对应的组分,得到包含端粒酶的粗提液。
[0018]优选的,步骤4)中所述高压破碎的次数为3~5次,相邻两次高压破碎的间隔时间为2~5min;所述超声粉碎的次数为2~4次,超声6~8s,间隔2~4s,每次超声的时间为2~4min。
[0019]优选的,步骤5)中所述上样的速度为1ml/min;所述洗脱的速度为2ml/min。
[0020]优选的,在步骤5)得到所述粗提液后,还包括对所述粗提液进行纯化,包括以下步骤:
[0021]6)采用sμmo酶和所述粗提液混合,进行sμmo酶切,得到第一蛋白,调整所述第一蛋白的盐浓度为280mM后,采用0.45μm滤头过滤,收集第二滤液;
[0022]7)将所述第二滤液加样至SP层析柱,洗脱液洗脱流出液,收集洗脱峰对应的组分并进行SDS

PAGE电泳,大小为100KD的蛋白为第二蛋白;
[0023]8)对所述第二蛋白以1ml/min的速度过抗EDTANI柱进行反挂,采用30KD的浓缩管,于1~5℃,3000~4000rpm的条件下第一浓缩至浓缩后的体积为0.5~1mL,得到第一浓缩液;
[0024]9)将所述第一浓缩液上样至S200层析柱,洗脱液洗脱流出液,收集洗脱峰对应的组分并进行SDS

PAGE电泳,大小为100KD的蛋白为第三蛋白;
[0025]10)采用30KD的浓缩管对所述第三蛋白于1~5℃,3000~4000rpm的条件下第二浓缩至浓缩后的体积为0.5~1mL,得到纯化端粒酶。
[0026]本专利技术的有益效果:本专利技术提供了表达端粒酶的基因,所述基因包括第一基因或第二基因,所述第一基因表达第一端粒酶;所述第二基因表达第二端粒酶;所述第一端粒酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述第二端粒酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术所述第一端粒酶来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis);所述第二端粒酶来源于白色念珠菌(Canidia albicans)。本专利技术表达端粒酶的基因能够在大肠杆菌、酵母菌和Sf9细胞中大量表达,且表达得到的端粒酶具有生物活性。
附图说明
[0027]图1为实施例2中Ni柱粗纯化结果;
[0028]图2为实施例2中SP柱纯化结果;
[0029]图3为实施例2中S200柱纯化结果;
[0030]图4为实施例2中S200柱纯化蛋白浓缩结果;
[0031]图5为实施例3中端粒酶活性鉴定;
[0032]图6为实施例6中pPICZA载体对应的电泳结果图;
[0033]图7为实施例6中pPICZaA载体对应的电泳结果图;
[0034]图8为实施例6中NI柱纯化结果;
[0035]图9为实施例6中SP柱纯化结果;
[0036]图10为实施例6中S200纯化结果;
[0037]图11为实施例6中浓缩结果;
[0038]图12为实施例6中活性测定结果;
[0039]图13为实施例8中NI柱纯化结果;
[0040]图14为实施例8中SP柱纯化结果;
[0041]图15为实施例8中S200纯化结果;
[0042]图16为实施例8中浓缩结果;
[0043]图17为实施例8中活性测定结果。
具体实施方式
本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.表达端粒酶的基因,所述基因包括第一基因或第二基因,所述第一基因表达第一端粒酶;所述第二基因表达第二端粒酶;所述第一端粒酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述第二端粒酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的基因,其特征在于,所述第一基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述第二基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种包括权利要求1或2所述基因的重组质粒,所述重组质粒的构建用骨架质粒包括pET15b

sμmo。4.根据权利要求3所述的重组质粒,其特征在于,所述重组质粒的构建用骨架质粒包括pET15b

sμmo、pPICZA、pPICZaA或pTrix。5.一种包括权利要求3或4所述重组质粒的重组细胞。6.根据权利要求5所述的重组细胞,其特征在于,当所述重组质粒的构建用骨架质粒为pET15b

sμmo时,所述重组细胞的原始细胞包括大肠杆菌;当所述重组质粒的构建用骨架质粒为pPICZA或pPICZaA时,所述重组细胞的原始细胞包括酵母菌;当所述重组质粒的构建用骨架质粒为pTrix时,所述重组细胞的原始细胞包括Sf9细胞。7.权利要求1或2所述的基因或者权利要求3或4所述的重组质粒或者权利要求5或6所述的重组细胞在制备端粒酶中的应用。8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,当所述重组细胞的原始细胞为大肠杆菌时,所述应用包括以下步骤:1)对所述重组细胞依次进行活化培养和扩大培养,得到菌液;所述菌液的OD
600
值为0.5~0.7;所述活化培养和扩大培养的培养基分别包括包含有氨苄的LB液体培养基;所述LB液体培养基中氨苄的浓度为80~120μg/mL;2)在所述菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷至异丙基硫代半乳糖苷的摩尔浓度为0.2~0.4mM,于100~200rpm、15~20℃的条件下诱导端粒酶表达12~18h,得到诱导液;3)对所述诱导液进行离心,收集...

【专利技术属性】
技术研发人员:奚绪光
申请(专利权)人:法国国家研究中心
类型:发明
国别省市:

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