一种适合在微生物中高效合成NAD衍生物的酶基因制造技术

本发明专利技术公开了一种适合在微生物中高效合成NAD衍生物的酶基因，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明专利技术通过在大肠杆菌中表达如SEQ ID NO.1～7任一所示的烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因VpNadV，并敲除pncC基因、ushA基因、nadR基因和purR基因，提高了大肠杆菌细胞中的NAD衍生物的积累量，并通过优化发酵条件，使NAD衍生物的积累量得到进一步提高，使5L发酵体系下可获得1g/L以上的NAD衍生物，在食品、药品、化妆品、饲料、纺织品领域具有广泛的应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种适合在微生物中高效合成NAD衍生物的酶基因


[0001]本专利技术涉及一种适合在微生物中高效合成NAD衍生物的酶基因，可适用于如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌等，属于基因工程及生物工程


技术介绍

[0002]早在20世纪30年代，人们就发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)以辅酶的形式参与诸多的氧化还原反应，起到重要作用。当时Warburg等证明NAD可以作为氢受体和氢供体参与氧化还原过程。随着科技的发展、技术手段的更新，NAD及其前体、衍生物和代谢酶最近被证明在多种生物学功能中同样起决定性作用，从经典的氧化磷酸化和氧化还原反应到调节基因转录、寿命和细胞死亡，从神经传递到轴突变性，从调节葡萄糖稳态到控制昼夜节律，氧化应激与免疫激活、能量代谢和细胞活性之间都存在着密切的相互关系。在不同生物中，NAD的生物合成过程略有不同，但都主要包含两条途径：从头合成途径和补救合成途径。从头途径中的喹啉酸(QA)和补救途径中的烟酰胺(NAM)、烟酸(NA)和烟酰胺核糖苷(NR)。喹啉酸、烟酸和烟酰胺被三种不同的磷酸核糖基转移酶：喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QAPRT)、烟酸磷酸核糖基转移酶(NAPRT)和烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt/NadV)用来催化合成各自的单核苷酸，即来自喹啉酸和烟酸的烟酸单核苷酸(NAMN)和来自烟酰胺的烟酰胺单核苷酸(NMN)。烟酸单核苷酸和烟酰胺单核苷酸随后被烟酰胺腺苷酸转移酶(Nampt/NadV)分别转化为烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)和NAD。NAD合成酶(NADS)将NaAD转化为NAD。
[0003]大肠杆菌作为一种重要的工业微生物，具有繁殖速度快、遗传背景清晰、基因编辑技术成熟等众多优点，是重要的异源蛋白表达宿主菌株，所以考虑将大肠杆菌作为NAD衍生物的合成宿主菌。在大肠杆菌中合成包含两条途径：以天冬氨酸起始的从头合成途径、以烟酸、烟酰胺和烟酰胺核糖苷存在的补救合成途径。天冬氨酸和烟酸经过不同的酶催化合成同一中间物烟酸单核苷酸(NaMN)，而烟酰胺需要脱氨转变为烟酸进而利用，缺少可以直接催化烟酰胺生成烟酰胺单核苷酸的酶(烟酰胺磷酸核糖基转移酶)。而烟酰胺单核苷酸作为NAD的一种重要前体物质，增加NMN的合成途径、增强NMN的合成量，也可达到强化NAD合成量的作用。烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt/NadV)主要存在于哺乳动物等高等动物，在某些细菌中也发现具有相同催化活性的酶。
[0004]目前NAD衍生物主要是通过酶法合成或化学合成等方法，但是这两种方式成本相比较微生物发酵法要更高一些。关于NAD衍生物的生物合成的相关报道非常少，并且检测到产量也是相对较低。所以寻找一种更高效的微生物合成法显得非常关键。上述提到的烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt/NadV)具有潜在的应用能力，可以一步催化NAD衍生物。在大肠杆菌中异源表达烟酰胺磷酸核糖基转移酶可以使得重组的大肠杆菌具有利用烟酰胺合成NAD衍生物的能力。由于原始的大肠杆菌中之前不存在表达烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因，需要表达来源不同的酶基因，根据文献相关报道，选取具有催化此反应能力的酶基因。从中筛选出最佳的酶基因。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本申请旨在寻找最高效合成NAD衍生物的酶基因，构建最利于NAD衍生物积累的重组菌株，降低NAD衍生物的生产成本，为工业化生产做基础，促使其对合成生物学的发展具有潜在的指导价值和指导意义。
[0006]本专利技术的第一个目的一种编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～7任一所示。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供含有所述基因的重组质粒，所述质粒上含有NAD衍生物合成途径的基因。
[0008]在一种实施方式中，编码所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因VpNadV的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]在一种实施方式中，所述质粒上海含有编码PRPP合酶的基因BaPRS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0010]在一种实施方式中，以pET28a作为质粒载体，连接有BaPRS和VpNadV，获得重组质粒pET28a+BaPRS+VpNadV。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供表达所述基因的重组微生物细胞，或携带所述重组质粒的重组微生物细胞。
[0012]在一种实施方式中，所述重组微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌。
[0013]在一种实施方式中，利用CRISPR
‑
Cas9基因编辑系统改造E.coli BL21(DE3)，敲除pncC基因，获得改造菌株F001 E.coli BL21(DE3),ΔpncC。
[0014]在一种实施方式中，利用CRISPR
‑
Cas9基因编辑系统改造F001 E.coli BL21(DE3),ΔpncC，敲除ushA基因，获得改造菌株F002 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA。
[0015]在一种实施方式中，利用CRISPR
‑
Cas9基因编辑系统改造F002 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA，敲除nadR基因，获得改造菌株F003 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR。
[0016]在一种实施方式中，利用CRISPR
‑
Cas9基因编辑系统改造F003 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR，敲除purR基因，获得改造菌株F004 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR、ΔpurR。
[0017]本专利技术的第四个目的是提供一种促进重组大肠杆菌合成NAD衍生物的方法，是在大肠杆菌中过表达如SEQ ID NO.4所示的烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因VpNadV，并敲除pncC基因、ushA基因、nadR基因和purR基因；所述pncC基因在NCBI数据库中的Gene ID为947169，ushA基因的Gene ID为947331，nadR基因的Gene ID为948911，purR基因的Gene ID为945226。
[0018]在一种实施方式中，所述方法还包括在培养所述重组大肠杆菌时，采用IPTG诱导。
[0019]在一种实施方式中，所述方法按照1％
‑
5％转接量转接至TB培养基中，35～37℃，培养1.5
‑
2h至OD
600
＝0.6
‑
1.0，再降温至24～26℃，加入终浓度0.2mM
‑
1mM IPTG，并添加100mg
‑
1000mg/L的烟酰胺。
[0020]在一种实施方式中，所述NAD衍生物包括但不限于：NR、NMN、NAD或NADH。
[0021]本专利技术的第五个目的是提供上述的重组大肠杆菌在食品、药品、化妆品、饲料、纺
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～7任一所示。2.含有权利要求1所述基因的重组质粒。3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，还含有编码PRPP合酶的基因BaPRS。4.表达权利要求1所述基因，或含有权利要求2～3任一所述重组质粒的微生物细胞。5.根据权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或谷氨酸棒杆菌。6.一种合成NAD衍生物的重组大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌中表达权利要求1所述的基因，或含有权利要求3所述的重组质粒。7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，黄忠实，曾伟主，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：