狂犬病疫苗抗原含量检测方法及试剂或试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种狂犬病疫苗抗原含量检测方法及试剂或试剂盒，所述检测方法包括：制备单克隆抗体包被酶标板，并固相化所述单克隆抗体；将待测疫苗、标准疫苗分别按照倍比梯度稀释，加入所述单克隆抗体包被酶标板中，孵育；再加入鼠多克隆抗体作为一抗，再加入适宜稀释度的辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物作为二抗，获取所述标准疫苗和所述待测疫苗在波长450nm处的OD值，计算所述待测疫苗的浓度。本发明专利技术通过设置人源化单克隆抗体包被酶标板、多克隆抗体作为一抗进行酶联免疫吸附实验检测狂犬病毒疫苗的抗原含量，且本发明专利技术的检测方法检测周期短、检测原料可长期储存，疫苗效价的检测结果简单易得。果简单易得。果简单易得。

【技术实现步骤摘要】
狂犬病疫苗抗原含量检测方法及试剂或试剂盒


[0001]本专利技术属于生物制剂领域，特别涉及一种狂犬病疫苗抗原含量检测方法及试剂或试剂盒。

技术介绍

[0002]狂犬病是一种由狂犬病毒引起的人兽共患传染病，一旦发病，死亡率几乎达100％。狂犬病病毒糖蛋白(GP)是狂犬病毒的主要保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体，同时还与病毒的毒力、神经嗜性，神经和脑内的运输、侵染和分布等有关。狂犬病疫苗的效价与病毒的糖蛋白密切关联，而现行版药典推荐NIH法体外检测作为狂犬病疫苗效价评价的标准方法。
[0003]NIH法是采用小鼠体内注射疫苗后，再用CVS攻击毒攻毒，经过与标准抗原比较后计算疫苗效价。NIH法检测需要大量小鼠，且每个实验周期约一个月时间，导致狂犬疫苗检测周期延长。且实验过程中由于活体参与，对小鼠状态和表现需要密切观察，导致检测成本高，疫苗效价计算繁琐。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术提供了一种狂犬病疫苗抗原含量检测方法及试剂或试剂盒。
[0005]一种狂犬病疫苗抗原含量检测方法，所述检测方法包括：
[0006]制备单克隆抗体包被酶标板，并固相化所述单克隆抗体；
[0007]将待测疫苗、标准疫苗分别按照倍比梯度稀释，将所述单克隆抗体包被酶标板洗板、拍干，将不同梯度稀释的所述待测疫苗和所述标准疫苗分别加入所述单克隆抗体包被酶标板中，37℃孵育1h；
[0008]将含有所述待测疫苗和标准疫苗的酶标板洗板拍干，再加入鼠多克隆抗体作为一抗，将含有所述一抗的酶标板封口后置于37℃孵育1h～2h；
[0009]将所述含有一抗的酶标板洗板拍干，再加入适宜稀释度的辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物作为二抗，得到含有二抗的酶标板，37℃孵育1h～2h；
[0010]将所述含有二抗的酶标板的洗板后，加入显色液，室温下避光反应设定时间，再加入终止液终止反应；
[0011]将所述终止反应的酶标板放入酶标仪中，获取所述标准疫苗和所述待测疫苗在波长450nm处的OD值，计算所述待测疫苗的浓度。
[0012]进一步地，制备所述单克隆抗体包被酶标板包括：
[0013]取所述单克隆抗体稀释后，加入酶标板中，2-8℃孵育过夜；
[0014]将所述单克隆抗体包被酶标板洗板3次后，加入封闭液封闭所述抗体，
[0015]再加入磷酸缓冲盐溶液将所述单克隆抗体固相化，制得所述单克隆抗体包被酶标板。
[0016]进一步地，所述单克隆抗体为针对狂犬病病毒糖蛋白抗原表位的人源化单克隆抗体。
[0017]进一步地，所述单克隆抗体包被酶标板内单克隆抗体添加量为100μl/孔，所述单克隆抗体浓度为1-20μg/ml。
[0018]进一步地，所述封闭液为牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖和葡萄糖中的一种，所述封闭液添加量为300μl/孔。
[0019]进一步地，所述磷酸缓冲盐溶液内含有蔗糖和果糖。
[0020]进一步地，所述多克隆抗体采用鼠脑来源狂犬病病毒制备。
[0021]进一步地，计算所述待测疫苗的浓度包括：
[0022]获取所述标准疫苗和所述待测仪表在酶标仪中波长450nm处的OD值；
[0023]依据所述标准疫苗波长450nm处的OD值建立浓度—OD值标准曲线；
[0024]将所述待测疫苗450nm处的OD值带入所述标准曲线计算出所述待测疫苗的浓度。
[0025]进一步地，所述酶标仪中还设置波长630nm，用于检测杂质干扰对照值。
[0026]一种狂犬病疫苗抗原含量检测试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括：人源化单克隆抗体、鼠多克隆抗体、辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物、显色液、终止液及医学上可接受的辅助材料。
[0027]本专利技术通过设置人源化单克隆抗体包被酶标板、多克隆抗体作为一抗按照酶联免疫吸附实验(ELISA法)的步骤检测狂犬病毒疫苗的抗原含量，检测周期短，能够快速获知检测结果；且检测过程中无需活体参与，即可获得疫苗效价结果，且所用检测原料可长期储存，疫苗效价的检测结果简单易得。
[0028]本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]图1示出了本专利技术实施例中各待测样品在不同稀释浓度下的OD值变化图；
[0031]图2A示出了本专利技术实施例不同标准品浓度对应的OD值曲线；
[0032]图2B示出了本专利技术实施例标准品的期望值与依据标准曲线计算出标准品浓度值关系曲线；
[0033]图3示出了本专利技术实施例根据ELISA法检测得到的GP含量与NIH法测得的效价值分散图；
[0034]图4示出了本专利技术实施例ELISA法检测结果与NIH法效价结果之间的关系图。
具体实施方式
[0035]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例
中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0036]狂犬病毒糖蛋白是唯一暴露于病毒包膜外的病毒蛋白，属于Ⅰ类跨膜糖蛋白，成熟糖蛋白以三聚棘突(长8.3nm)形式位于狂犬病毒双层脂膜上，在病毒的细胞粘附、膜融合及轴浆运输过程中发挥重要作用。成熟糖蛋白由505个氨基酸组成，分成3个区域：膜外区1～439位氨基酸，跨膜区440～461位氨基酸，膜内区462～505位氨基酸。
[0037]糖蛋白上至少存在3个主要中和抗体结合位点：抗原位点Ⅰ～Ⅲ，此外，还有一些次要线性表位。其中抗原位点I位于218～240位氨基酸区域，是一个次要线性中和表位，其最小结合区为KLCGVL(226～231位)，核心残基为K-CGV-。Ⅱ号位点是由第34～42位和第198～200位氨基酸两个位点通过二硫键C35-C207形成的一个保守性较高的空间表位，其中34～42位、147位、184位和198～200位氨基酸至关重要。Ⅲ号位点位于330～357位氨基酸，也是一个空间表位，其中333～338位氨基酸区段是中和抗体主要结合部位，位于342～343位的a表位是次要的中和位点，第330位、333位、336位及338位氨基酸是关键残基。Ⅱ号和Ⅲ号抗原位点是主要病毒中和表位，两位点在空间上十分接近，其中一些关键残基突变可对病毒的毒力、宿主范围或传播速度产生影响。实验发现，糖蛋白上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种狂犬病疫苗抗原含量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：制备单克隆抗体包被酶标板，并固相化所述单克隆抗体；将待测疫苗、标准疫苗分别按照倍比梯度稀释，将所述单克隆抗体包被酶标板洗板、拍干，将不同梯度稀释的所述待测疫苗和所述标准疫苗分别加入所述单克隆抗体包被酶标板中，37℃孵育1h；将含有所述待测疫苗和标准疫苗的酶标板洗板拍干，再加入鼠多克隆抗体作为一抗，将含有所述一抗的酶标板封口后置于37℃孵育1h～2h；将所述含有一抗的酶标板洗板拍干，再加入适宜稀释度的辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物作为二抗，得到含有二抗的酶标板，37℃孵育1h～2h；将所述含有二抗的酶标板的洗板后，加入显色液，室温下避光反应设定时间，再加入终止液终止反应；将所述终止反应的酶标板放入酶标仪中，获取所述标准疫苗和所述待测疫苗在波长450nm处的OD值，计算所述待测疫苗的浓度。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，制备所述单克隆抗体包被酶标板包括：取所述单克隆抗体稀释后，加入酶标板中，2-8℃孵育过夜；将所述单克隆抗体包被酶标板洗板3次后，加入封闭液封闭所述抗体，再加入磷酸缓冲盐溶液将所述单克隆抗体固相化，制得所述单克隆抗体包被酶标板。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭小东，李杰玉，周沛，杨世龙，
申请(专利权)人：重庆智飞生物制品股份有限公司北京智飞绿竹生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：