一种肺炎球菌多糖的纯化工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种离子交换层析纯化肺炎球菌多糖的工艺。步骤包括：肺炎球菌经发酵培养、灭活、澄清、超滤浓缩等步骤得到肺炎球菌多糖粗提溶液，通过离子交换层析工艺，去除不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖纯化过程的杂质，得到符合要求的肺炎球菌多糖。到符合要求的肺炎球菌多糖。到符合要求的肺炎球菌多糖。

【技术实现步骤摘要】
一种肺炎球菌多糖的纯化工艺


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种肺炎球菌多糖的纯化工艺。

技术介绍

[0002]层析技术是生物大分子分离纯化最有效的手段之一,具有多种不同的分离机理如离子交换、疏水、反相、金属鳌合、亲和、凝胶过滤等,可以实现很高的分离度,且设备简单,便于自动化控制,不会在分离过程中出现发热、相变等效应,因此在实际的生物大分子分离纯化中的应用越来越广泛。离子交换层析是以离子交换剂为固定相,以特定的含离子的溶液为流动相,利用离子交换剂对需要分离的生物大分子结合的差异,而将混合物中各种物质进行分离的层析技术。
[0003]肺炎球菌荚膜多糖是制备肺炎球菌相关疫苗的有效抗原。肺炎球菌荚膜多糖经细菌发酵培养后，现有的肺炎球菌多糖的纯化工艺是苯酚抽提和乙醇分级沉淀纯化得到。然而苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能，对环境水体和大气都可造成污染。乙醇是易燃易爆危险化学品，对生产厂房设计要求极高，对生产成本影响很大。并且有毒、有害和污染严重的有机化剂的使用对工作人员和环境造成危害，所以研制创新性的、安全和有效的纯化工艺是迫切需要的。
[0004]本专利技术的纯化工艺，是指肺炎球菌经发酵培养、灭活、澄清、超滤浓缩等步骤得到粗纯肺炎球菌多糖，然后经离子交换层析去除蛋白和核酸等杂质，最终得到肺炎球菌荚膜多糖。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种肺炎球菌多糖的纯化工艺。
[0006]本专利技术主要是针对层析过程，层析使用的介质为阴离子交换介质，不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖的性质，使用不同稀释液，达到去除杂质的目的；针对不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖的性质，使用不同上样量，提高了层析的效率；并优化了层析介质的清洗程序，延长了层析介质使用寿命。
[0007]现有方法制备得到的肺炎球菌多糖，纯度比较低，为粗纯多糖。本专利技术对粗纯多糖作进一步层析纯化，得到纯度更高的肺炎球菌荚膜多糖。
[0008]具体的，本专利技术所述的肺炎球菌多糖的纯化工艺，包括以下步骤：
[0009](1)配制层析平衡液为0.01mol/L至0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH值范围为6.0至7.6。
[0010](2)将肺炎球菌粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为10到100Kd，使用层析平衡液透析，透析后收集超滤浓缩液。
[0011](3)用层析平衡液平衡层析柱。
[0012](4)上样，使用平衡缓冲液洗脱，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰。
[0013]其中，层析使用的离子交换介质为离子交换介质DEAE Sepharose FF。
[0014]其中，肺炎球菌粗纯多糖，可以在市场上购买到，也可以根据常规方法制备得到。
[0015]此处，列举一种肺炎球菌粗纯多糖的制备方法，当然还可以根据其他方法制备得到。
[0016]其中，肺炎球菌粗纯多糖的制备步骤为：
[0017]24个血清型中的任一个肺炎链球菌血清型进行发酵，肺炎球菌灭活，发酵液澄清，发酵液进行超滤浓缩，加CTAB使其与多糖形成沉淀，离心收集沉淀，再经过氯化钠解聚，离心收集上清，超滤浓缩和缓冲液置换，层析纯化多糖，注射用水超滤除盐，冻干，最终得到肺炎球菌粗纯多糖。
[0018]本专利技术所述的纯化工艺，适用于肺炎链球菌血清型为1型、2型、3型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、12F型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型和33F型。
[0019]肺炎链球菌血清分为24个血清型，根据不同型的血清，本专利技术采用不同的纯化工艺。
[0020]本专利技术将24个血清型进行筛选，根据其缓冲液浓度和上样体积分为6组，对应6种不同的纯化方法，具体筛选方法在实施例中详细说明。
[0021]第1组，针对肺炎链球菌血清型2型、9N型、9V型、10A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、20型、22F型和23F型的粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：
[0022](1)配制层析平衡液：为0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测平衡液电导值，范围在20
±
2mS/cm；检测平衡液pH值，范围为7.50
±
0.10；
[0023](2)将粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用层析平衡液透析至电导一致，透析结束后收集超滤浓缩液；
[0024](3)用层析平衡液平衡层析柱，至电导率稳定；
[0025](4)层析上样量不超过0.25柱体积(以下简写为CV)，使用平衡缓冲液洗脱流穿峰，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰，即肺炎多糖层析组分。
[0026]第2组，针对肺炎链球菌血清型4型、8型、19A型和19F型的粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：
[0027](1)层析平衡液为0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测透析液电导值，范围在40
±
4mS/cm；检测透析液pH值，范围为7.50
±
0.10；
[0028](2)将粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用层析平衡液透析至电导一致，透析结束后收集超滤浓缩液；
[0029](3)用层析平衡液平衡层析柱，至电导率稳定；
[0030](4)层析平衡液的上样量不超过0.25CV，使用层析平衡液洗脱流穿峰，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰，即肺炎多糖层析组分。
[0031]第3组，针对肺炎链球菌血清型6A型和6B型的粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：
[0032](1)配制层析平衡液为0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测平衡液电导值，范围在20
±
2mS/cm，检测平衡液pH值，范围为7.50
±
0.10；配制层析洗脱液为0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测洗脱液电导值，范围在40
±
4mS/cm，检测洗脱液pH值，范围为7.50
±
0.10；
[0033](2)将粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用层析平衡液透
析至电导一致，透析结束后收集超滤浓缩液；
[0034](3)用层析平衡液平衡层析柱，至电导率稳定。
[0035](4)上样量不超过0.25CV，保持流速，使用层析平衡液洗脱1CV，再使用层析洗脱液洗脱2CV，监测206nm的紫外吸收峰，收集洗脱峰，即肺炎多糖层析组分。
[0036]第4组，针对肺炎链球菌血清型1型、5型、7F型和33F型的粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：
[0037](1)配制层析平衡液：为0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测平衡液电导值，范围在20
±
2mS/cm；检测平衡液pH值，范围为7.50
±
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肺炎球菌多糖的纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制层析平衡液为0.01mol/L至0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH值范围为6.0至7.6；(2)将肺炎球菌粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为10到100Kd，使用层析平衡液透析，透析后收集超滤浓缩液；(3)用层析平衡液平衡层析柱；(4)上样，使用平衡缓冲液洗脱，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰。2.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，该纯化工艺适用于肺炎链球菌血清型为1型、2型、3型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、12F型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型和33F型。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：层析使用的离子交换介质为离子交换介质DEAE Sepharose FF。4.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，第1组，针对肺炎链球菌血清型2型、9N型、9V型、10A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、20型、22F型和23F型的粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：(1)配制层析平衡液：为0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测平衡液电导值，范围在20
±
2mS/cm；检测平衡液pH值，范围为7.50
±
0.10；(2)将粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用层析平衡液透析至电导一致，透析结束后收集超滤浓缩液；(3)用层析平衡液平衡层析柱，至电导率稳定；(4)层析上样量不超过0.25柱体积(以下简写为CV)，使用平衡缓冲液洗脱流穿峰，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰，即肺炎多糖层析组分。5.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，第2组，针对肺炎链球菌血清型4型、8型、19A型和19F型的粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：(1)层析平衡液为0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测透析液电导值，范围在40
±
4mS/cm；检测透析液pH值，范围为7.50
±
0.10；(2)将粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用层析平衡液透析至电导一致，透析结束后收集超滤浓缩液；(3)用层析平衡液平衡层析柱，至电导率稳定；(4)层析平衡液的上样量不超过0.25CV，使用层析平衡液洗脱流穿峰，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰，即肺炎多糖层析组分。6.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，第3组，针对肺炎链球菌血清型6A型和6B型的粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：(1)配制层析平衡液为0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测平衡液电导值，范围在20
±
2mS/cm，检测平衡液pH值，范...

【专利技术属性】
技术研发人员：马可，朱卫华，胡国伟，李爽，林彦斌，王瑞峰，杜琳，
申请(专利权)人：重庆智飞生物制品股份有限公司安徽智飞龙科马生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：