一种23价肺炎球菌多糖疫苗的生产工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种23价肺炎球菌多糖疫苗的生产工艺，所述工艺采用CTAB沉淀

【技术实现步骤摘要】
一种23价肺炎球菌多糖疫苗的生产工艺


[0001]本专利技术属于肺炎疫苗领域，涉及一种23价肺炎球菌多糖疫苗(包括1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F等23种肺炎链球菌血清型)的生产工艺。

技术介绍

[0002]肺炎链球菌是一类革兰染色阳性致病菌，1881年被首次分离识别。肺炎球菌表面黏液层的化学成分为多糖的荚膜是主要的致病物质之一，具有抗原性，并因其结构相异将肺炎球菌划分为90多个血清型。肺炎链球菌荚膜多糖具有免疫原性，可以激发产生保护性抗体，4价、14价、23价肺炎多糖疫苗相继应运而生。其中，23价肺炎球菌多糖疫苗是现有的包含种类最多的一种肺炎多糖疫苗，是通过对23种不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖抗原纯化后按配方混合而成，全球85～90％侵袭性肺炎球菌感染是由此23种血清型造成。
[0003]23价肺炎球菌荚膜多糖疫苗可对相应的肺炎链球菌产生抗体，为非T细胞依赖型抗原，可诱导机体产生IgM，在接种后的第3周，抗体的产生达到高峰，且有效抗体水平至少可持续5年。各疫苗上市生产企业已然具备成熟的肺炎多糖疫苗制备工艺，但制备过程多以传统生产工艺进行多糖疫苗的制备，工艺过程中多以25％乙醇沉淀核酸、苯酚抽提法去除蛋白进行荚膜多糖精制，而且伴随大量乙醇进行分级沉淀多糖。工艺方法中引入的苯酚具高毒性，污染生产环境，且影响产品的安全性，大量有机乙醇的使用也增大了操作安全隐患。
[0004]为提高肺炎多糖的产率、疫苗的安全性及有效性，肺炎多糖生产工艺在不断进行技术创新提升。专利CN102257127A提出产生高分子量的分离的肺炎链球菌荚膜多糖溶液的改良方法，具体方法是向6A、6B、19和19F这类含有磷酸二酯键的肺炎链球菌血清型的培养基中提供CO2、HCO3‑
或CO
32
‑
；专利CN103833865A则利用灭活后的培养液经离心、膜分离、分段醇沉、层析的方法提纯肺炎荚膜多糖，该专利技术在纯化工艺中避免了有机试剂及酶的使用，改进多糖生产纯化工艺；类似的，专利CN107936128A在肺炎多糖生产纯化工艺也提出改良方法，具体的以控制发酵液的细菌密度、裂解剂浓度、添加裂解剂后的裂解时间及控制pH，可直接经离心、超滤等步骤后用乙醇沉淀多糖，即为精制多糖，该方法取消微滤、层析等步骤，取消CTAB、酶、苯酚等物料的使用，且收率高、操作简单等优点，然而工艺中以乙醇沉糖、以无水乙醇及丙酮洗糖，增加了工艺操作安全风险；专利CN105131139A则是引入核酸酶处理的方法纯化肺炎多糖，极大的缩短了工艺时间，然而核酸酶的使用却提高了生产成本；专利CN104781413A提出的另外培养可以利用培养产物(乳酸等)使pH降低至适合蛋白沉淀的范围，去除了pH调节剂酸化的蛋白沉淀过程，使多糖生产工艺简化；专利CN111893084A中提出向肺炎链球菌发酵体系中连续补料含有己醇胺的发酵培养基，可实现高密度发酵，并声明该方法可极大的提高多糖产量(产量提高3～6倍)。
[0005]肺炎荚膜多糖生产工艺的技术创新是为了更快速高效生产的更安全可靠的肺炎疫苗，本专利技术在肺炎球菌荚膜多糖生产工艺优化升级的基础上提出一种23价肺炎球菌多糖
疫苗的制备方法。具体的，肺炎链球菌菌种复苏、扩增后，进行发酵培养，于对数生长期后期或稳定期前期收获，在收获的培养液中加入脱氧胆酸钠溶液进行灭活，高速离心去除菌体，加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，收集沉淀或上清，收集的沉淀或上清液继续纯化，经过解离、沉淀、超滤、层析、冻干等工序，得到白色固体为肺炎球菌多糖，将各型别肺炎多糖按配方混合得到23价肺炎多糖疫苗。
[0006]特别的，本专利技术提出的23价肺炎球菌多糖疫苗生产工艺特别在肺炎多糖制备工艺进行了技术创新，提供了一种新的肺炎球菌多糖的制备方法。主要体现在：
[0007](1)本专利技术提供了23个型别肺炎球菌多糖的新的制备方法，尤其是提供了8、10A、11A、12F、14、15B、17F、20、22F、23F和33F等型别的一种新的多糖制备工艺。
[0008](2)本专利技术提供的肺炎球菌多糖生产工艺，通过调节葡萄糖补加速度，控制发酵过程葡萄糖浓度，进而控制发酵过程菌体浓度；通过控制添加裂解剂浓度、裂解时间及控制pH，保证菌体破碎及蛋白沉淀效果。
[0009](3)本专利技术提供的肺炎球菌多糖生产工艺，控制料液缓冲溶液的离子强度及酸碱度，使酸性多糖(或酸性杂质)与CTAB形成不溶性沉淀物，且在适宜离子强度的含氯离子溶液中多糖被重新解离出来。
[0010](4)本专利技术提供的肺炎球菌多糖生产工艺，采用加入碘化钠溶液去除大部分引入的CTAB。电离产生的I
‑
会降低CTAB的临界胶束浓度，使大部分CTAB以胶束形式沉淀，离心分离，残留的CTAB采用超滤技术去除。
[0011](5)本专利技术提供的肺炎球菌多糖生产工艺，以羟基磷灰石为离子交换介质，用合适浓度的磷酸盐缓冲液平衡层析介质，多糖溶液上样至层析柱，蛋白及核酸杂质与介质结合，目标成分多糖则流穿，因此收集多糖洗脱峰，可去除大部分核酸与蛋白。
[0012](6)本专利技术提供的肺炎球菌多糖生产工艺，将多糖溶液以冷冻干燥的方法获取固体肺炎多糖。用冷冻干燥能够较好保持被干燥物的形貌与性能的特点，替代了75～80％乙醇沉淀多糖、无水乙醇、无水丙酮干燥多糖的生产工艺。
[0013](7)本专利技术提供的肺炎球菌多糖生产工艺，过程料液澄清过滤采用0.65um玻璃纤维材质滤芯或深层过滤器，可以解决因料液堵塞膜材问题。
[0014](8)本专利技术提供的肺炎球菌多糖生产工艺，未采用传统25％乙醇沉淀杂质，75％乙醇沉淀多糖的步骤，避免了引入有机试剂乙醇、丙酮，生产安全及产品安全性均提高。
[0015](9)本专利技术该提供的肺炎球菌多糖生产工艺，未采用传统的酚抽提去除蛋白的工艺，避免了引入高毒性苯酚，工艺过程有更高的安全性、稳定性和重现性，产品更安全。

技术实现思路

[0016]本专利技术提供了23个型别肺炎球菌多糖的新的制备方法，尤其是提供了2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F、33F等10个型别肺炎链球菌血清型多糖的制备方法。
[0017]本专利技术所述的23价肺炎球菌多糖的制备方法，包括如下步骤：
[0018](1)肺炎球菌的培养及发酵；
[0019](2)发酵收获液杀菌、沉淀及离心；
[0020](3)发酵上清液CTAB沉淀酸性多糖或杂质；
[0021](4)解离、沉淀CTAB；
[0022](5)层析进一步去除核酸及蛋白；
[0023](6)纯化后样品超滤、冻干制成肺炎球菌多糖；
[0024]其中，步骤(1)肺炎球菌的培养及发酵，方法为：
[0025]1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.23价肺炎球菌多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)肺炎球菌的培养及发酵；2)发酵收获液杀菌、沉淀及离心；3)发酵上清液CTAB沉淀酸性多糖或杂质；4)解离、沉淀CTAB；5)层析进一步去除核酸及蛋白；6)纯化后样品超滤、冻干制成肺炎球菌多糖；其中，步骤1)肺炎球菌的培养及发酵工艺中，以哥伦比亚血琼脂培养基开启工作菌种，培养条件为37
±
1℃、10％CO2；复苏后于液体培养基中扩增培养，培养条件为37
±
1℃、4％～6％CO2；菌体发酵培养于胰酪大豆液体培养基中进行，培养条件为35～38℃、pH在6.6～7.5之间，培养过程控制葡萄糖补料浓度在5～25mmol/L之间控制菌体浓度。2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，胰酪大豆液体培养基中添加40mg/L的Mg
2+
及0.1～0.3ml消泡剂。3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤2)发酵收获液杀菌、沉淀及离心中，以脱氧胆酸钠杀菌，脱氧胆酸钠终浓度为0.06～0.24％，灭活4小时以上；用醋酸溶液调pH值至4.0～6.0，静置沉淀杂质4小时以上；离心，上清液调pH值至中性，用0.65um玻璃纤维滤芯澄清过滤后，用100KD膜包浓缩，用不少于5倍体积缓冲溶液进行超滤。4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤3)用碳酸钠溶液调节料液pH值至7.2～7.6，加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，至CTAB终浓度为1～3％，混合均匀后沉淀过夜，离心收集目标成分。5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤4)向步骤3)所得沉淀物中加入0.2～0.5mol/L的氯化钠溶液，使多糖与CTAB解离12小时以上，离心收集上清液；向所得上清液或步骤3)收集的上清液中加入碘化钠至终浓度为0.2～1.5％，混合均匀，静置沉淀1小时以上，离心，上清液经0.65um玻璃纤维材质滤芯澄清过滤后，用100KD膜包浓缩，用不少于5倍体积的缓冲溶液进行超滤。6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤5)层析进一步去除核酸及蛋白中，23个型肺炎多糖均以II型羟基磷灰石为层析介质，0.002～0.01mol/L磷酸盐缓冲液作为平衡液，纯化过程中，监测206nm吸收值，收集主流穿峰为多糖组分，层析后层析柱以0.5～1.0mol/L的磷酸缓冲生理盐水进行再生。7.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤6)层析后样品用100KD膜包、冷却注射用水进行透析，透析体积应不低于浓缩料液5倍体积，并在线检测透过液电导应小于10μs/cm；多糖溶液澄清过滤后冻干，温度降至
‑
40℃以下后保温，应不低于4h；产品完全冻结后在真空状态下进行水分升华，升华过程应不低于50h；待制品冰层完全消失后进入解析干燥阶段，保温过程应不低于4h；冻干过程产品温度应不高于30℃；冻干结束，应为白色疏松固体，即为纯化的肺炎球菌多糖。8.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)肺炎球菌的培养及发酵：以哥伦比亚血琼脂培养基开启工作菌种，培养条件为37
±
1℃、10％CO2；复苏后于液体培养基中扩增培养，培养条件为37
±
1℃、4％～6％CO2；转移至发酵罐以胰酪大豆液体培养
基进行菌体发酵培养，培养温度36～38℃，pH值在6.8～7.2之...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏晓叶，王瑞峰，林彦彬，刘刚，朱卫华，杜琳，
申请(专利权)人：重庆智飞生物制品股份有限公司安徽智飞龙科马生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：