一种纯化17F型肺炎球菌多糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种简化的、安全的、有效的纯化17F型肺炎球菌多糖的工艺。本发明专利技术的方法，菌液粗裂解液经超滤置换成含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS，然后添加CTAB反应后直接收集上清液，不再需要进行氯化钠解聚离心步骤，具有工艺流程简化、易于操作、生产的多糖杂质含量更低、产量更高的特点，减少了工艺步骤，节省了工艺用时和生产成本、生产的多糖更加安全有效，值得在荚膜多糖疫苗生产中推广、使用。使用。使用。

【技术实现步骤摘要】
一种纯化17F型肺炎球菌多糖的方法


[0001]本专利技术属于生物制药领域，涉及一种纯化17F型肺炎球菌多糖的方法。

技术介绍

[0002]肺炎球菌多糖疫苗生产因为涉及多个复杂的生产过程而成本高昂，如细菌培养，荚膜多糖纯化等。因此，改进以上步骤的任一步骤都有助于提高疫苗生产成本的效益比。
[0003]20世纪50年代，Scott首先发现十六烷基三甲基铵(CTAB)对酸性多糖有较强的沉淀作用，能与多糖形成季胺络合物而沉淀多糖。十六烷基三甲基铵(CTAB)是一种阳离子表面活性剂，具有从低离子强度溶液中沉淀酸性物质的特性，已经被广泛用于从多种细菌培养上清液中沉淀荚膜多糖。在高离子强度的溶液中，CTAB与蛋白质和多糖形成复合物。该反应基于CTAB的正电荷与CPS负电荷之间的相互作用。
[0004]现有使用CTAB沉淀17F型肺炎球菌多糖的工艺中，如美国专利需要将肺炎球菌粗裂解物进行浓缩透析，透析液使用pH值中性的磷酸盐溶液，然后向浓缩液中加入CTAB以分离多糖与蛋白质、核酸等杂质，反应完成后收集沉淀，向沉淀中加入氯化钠进行解聚，然后进行后续的分离纯化。
[0005]本专利技术的创新点在于对CTAB反应的工艺进行了优化，不再需要进行氯化钠解聚，简化了纯化工艺，节约了生产成本，最终收获了收率更高、质量更高的多糖。

技术实现思路

[0006]本专利技术提出了一种简便的可放大的用于17F型肺炎球菌多糖纯化的工艺。
[0007]本专利技术在现有专利的基础上进行了改进，使用了一种全新的菌液上清透析液，不再需要进行氯化钠解聚步骤。
[0008]使用本工艺进行纯化，得到了纯度更高的多糖，并提高了多糖收率。
[0009]具体的，本专利技术所述的肺炎球菌多糖纯化工艺，包括以下步骤：(1)将17F型肺炎链球菌经发酵、灭活、离心、澄清后得到菌液上清；(2)将菌液上清使用截留分子量为100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，使用中性pH值的磷酸盐缓冲溶液完成透析，透析结束后收集超滤浓缩液；(3)向超滤浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度为1％，分离多糖与蛋白质、核酸等杂质，离心收集上清得到CTAB上清液；(4)向CTAB上清液中加入碘化钠(NaI)至终浓度为0.5％以沉淀CTAB，离心收集上清得到NaI上清液；(5)将NaI上清液经超滤浓缩后使用阳离子交换柱进行纯化、经超滤、冻干后收获多糖。其中，骤(2)中超滤透析液为含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS，pH值为中性。其中，步骤(3)中CTAB反应完成后，收集上清液，无需进行氯化钠解聚即可进行后续的碘化钠沉淀步骤。
优选的，本专利技术所述的肺炎球菌多糖纯化工艺，包括以下步骤：
[0010](1)将肺炎链球菌经发酵、灭活、离心、澄清后得到菌液上清；
[0011](2)将菌液上清使用截留分子量为100KD的超滤膜包进行浓缩和透析，使用中性pH值的含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS完成透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
[0012](3)向超滤浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度为1％，离心收集上清得到CTAB上清液；
[0013](4)向CTAB上清液中加入碘化钠(NaI)至终浓度为0.5％以沉淀CTAB，离心收集上清得到NaI上清液；
[0014](5)将NaI上清液使用截留分子量为10到100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
[0015](6)将超滤浓缩液使用羟基磷灰石层析柱进行纯化，收集多糖流穿峰；
[0016](7)将收集的多糖流穿峰使用截留分子量为10到100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，透析溶液为注射用水(WFI)，透析结束后收集超滤浓缩液；
[0017](8)将透析的多糖溶液进行冷冻干燥以去除水分，得到的多糖样品用于测试，并将纯化的多糖冷冻储存。
[0018]对收获的多糖进行理化项目检测，具体检测方法参考《中国药典》。
[0019]本专利技术提出的纯化工艺相对于现有的纯化工艺，工艺中不再需要进行氯化钠解聚，简化了工艺，降低了生产成本，提高了生产效率。
附图说明
图1为17F工艺流程图。图2、四批次17F型肺炎球菌多糖的抗原性试验图3、17F型01批色谱图和重均分子量数据图谱图4、17F型02批色谱图和重均分子量数据图谱图5、17F型03批色谱图和重均分子量数据图谱图6、17F型04批色谱图和重均分子量数据图谱
具体实施方式
[0020]下面结合实施例对本专利技术作进一步描述，但本专利技术的保护范围不局限于以下所述。实施例1、肺炎球菌多糖纯化工艺(1)将肺炎链球菌经发酵、灭活、离心、澄清后得到菌液上清；(2)将菌液上清使用截留分子量为100KD的超滤膜包进行浓缩和透析，使用中性pH值的含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS完成透析，透析结束后收集超滤浓缩液；(3)向超滤浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度为1％，离心收集上清得到CTAB上清液；(4)向CTAB上清液中加入碘化钠(NaI)至终浓度为0.5％以沉淀CTAB，离心收集上清得到NaI上清液；(5)将NaI上清液使用截留分子量为10到100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
(6)将超滤浓缩液使用羟基磷灰石层析柱进行纯化，收集多糖流穿峰；(7)将收集的多糖流穿峰使用截留分子量为10到100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，透析溶液为注射用水(WFI)，透析结束后收集超滤浓缩液；(8)将透析的多糖溶液进行冷冻干燥以去除水分，得到的多糖样品用于测试，并将纯化的多糖冷冻储存。试验例1、
[0021]现有专利
[0022](1)配制菌液上清超滤透析液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液PB，pH值为中性；
[0023](2)将肺炎链球菌经发酵、灭活、离心后得到的菌液上清进行超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用超滤透析液进行透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
[0024](3)向超滤浓缩液中加入CTAB，经CTAB反应、离心收集沉淀、氯化钠解聚、层析、冻干后收获多糖。
[0025]本专利：
[0026](1)配制菌液上清超滤透析液为含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS，pH值为中性；
[0027](2)将肺炎链球菌经发酵、灭活、离心后得到的菌液上清进行超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用超滤透析液进行透析，透析结束后收集超滤浓缩液。
[0028](3)向超滤浓缩液中加入CTAB，经CTAB反应、离心收集上清液、层析、冻干后收获多糖。
[0029]通过本专利技术工艺所获得的17F型肺炎球菌多糖各项理化指标与国家药典标准进行比较，结果如下：
[0030][0031]可以发现，本工艺实施例所获得的17F型肺炎球菌多糖各项理化指标均符合国家药典标准，并且蛋白质、核酸、内毒素等本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化肺炎球菌多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将17F型肺炎链球菌经发酵、灭活、离心、澄清后得到菌液上清；(2)将菌液上清使用截留分子量为100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，使用中性pH值的磷酸盐缓冲溶液完成透析，透析结束后收集超滤浓缩液；(3)向超滤浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度为1％，分离多糖与蛋白质、核酸等杂质，离心收集上清得到CTAB上清液；(4)向CTAB上清液中加入碘化钠(NaI)至终浓度为0.5％以沉淀CTAB，离心收集上清得到NaI上清液；(5)将NaI上清液经超滤浓缩后使用阳离子交换柱进行纯化、经超滤、冻干后收获多糖。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该纯化工艺适用于肺炎链球菌血清型17F型。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中超滤透析液为含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS，pH值为中性。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中CTAB反应完成后，收集上清液，无需进行氯化钠解聚即可进行后续的碘化...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞峰，林彦彬，苏晓叶，杜琳，刘刚，朱卫华，
申请(专利权)人：重庆智飞生物制品股份有限公司安徽智飞龙科马生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：