一种双价痢疾结合物组合疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种双价痢疾结合物组合疫苗的制备方法，属于生物制品制备技术领域。该疫苗包括福氏2a菌和宋内氏菌两种血清型，将两种菌的O

【技术实现步骤摘要】
一种双价痢疾结合物组合疫苗的制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种双价痢疾结合物组合疫苗的制备方法。

技术介绍
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[0002]痢疾杆菌属于革兰氏阴性细胞内致病菌，临床上可引起细菌性痢疾，肠道的炎症反应是痢疾杆菌病的一个重要特征，主要表现为结肠的水肿、溃疡及炎症。随着生活条件和卫生条件的提高有所改善，但由于抗生素的滥用和耐药病株的出现，痢疾杆菌病仍然是一种常见的、越来越难以治疗的疾病。
[0003]痢疾杆菌包括4个种48个血清型，在非洲和亚洲，约90％的菌痢由福氏菌和宋内菌引起。其中，福氏菌2a菌是福氏菌的主要血清型。
[0004]多糖蛋白结合疫苗是通过化学方法将多糖抗原与载体蛋白共价结合，可诱导≤2岁儿童、老年人及免疫缺陷者体内产生有效的免疫应答，并产生免疫记忆，诱生的保护性抗体主要为免疫球蛋白IgG，比多糖疫苗诱生的IgM更有效，且能维持较长时间，具有多糖疫苗不可比拟的优势。多糖蛋白结合疫苗是通过化学方法将多糖抗原与载体蛋白共价结合，主要方法有三种：直接结合法、还原胺法和氰基活化法，随着结合技术的发展，以这三种结合方法为基础，发展出了一些新的结合手段例如在多糖和蛋白间引入分子臂己二酸二酰肼(ADH)，促进多糖和蛋白的结合，或者引入新的连接基团，促进结合反应的发生。
[0005]目前国内用于结合疫苗的常用载体蛋白主要是破伤风类毒素(tetanus toxoid， TT)和白喉类毒素(diphtheria toxoid，DT)，TT和DT的分子量分别为151 千道尔顿(kilodalton，kD)和58kD，类毒素已被成功用于多种多糖蛋白结合疫苗中。
[0006]痢疾结合疫苗是20世纪90年代后兴起的一种痢疾疫苗研制思路。以痢疾菌的O抗原为目标抗原，通过与蛋白质载体连接制备的多糖蛋白质结合疫苗，均采用溴化氰活化，但是溴化氰活化和碳二亚胺(EDAC)介导制备结合物的痢疾结合疫苗保护效果不佳。这可能是由于氰基活化过程需要在pH 10.5的环境中进行，这种碱性环境影响多糖上的氧乙酰基，对疫苗的免疫效果产生潜在影响。而且这种结合物为交联的网状结构，形成的结合物分子量相对较大，不利于结合物的层析纯化和经除菌过滤等工序操作。
[0007]针对痢疾的疫苗研究已经开发了几十年；不幸的是，到目前为止，还没有获得许可的疫苗。本专利技术公开了一种双价痢疾结合物组合疫苗的制备方法，该疫苗包括福氏2a菌和宋内氏菌两种血清型，将两种菌的O
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特异性多糖依据其特有的化学结构与载体蛋白通过相应的化学方法共价结合制备多糖蛋白结合物原液，其中，福氏2a痢疾多糖采用还原胺法制备结合物，由于多糖结构中不含有羧基，不能和ADH或载体蛋白直接反应，但含有相邻的羟基，所以多糖需先经过高碘酸钠氧化，生成醛基，再与ADH中一端氨基形成衍生物，经硼氰化钠还原后形成多糖衍生物，最后ADH另一端与载体蛋白的活性氨基反应，形成稳定的共价结合物。宋内氏痢疾多糖采用直接结合法制备结合物，宋内氏痢疾多糖含有羧基，直接与ADH中一端氨基形成多糖衍生物，最后ADH另一端与载体蛋白的活性氨基反应，形成稳定的共价结合物。多糖蛋白结合物原液再与铝佐剂按适当比例吸附后获得痢疾结合疫苗。

技术实现思路
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[0008]本专利技术涉及一种双价痢疾结合物组合疫苗的制备方法，所述组合疫苗是由两种痢疾杆菌的多糖蛋白结合物组合而成，所述结合物为相应血清型的痢疾多糖与生理上可接受的载体蛋白通过选择不同的结合方法制备的多糖蛋白结合物，多糖蛋白结合物原液再与铝佐剂按适当比例吸附后获得痢疾结合疫苗，所述的结合方法采用两种或两种以上的结合方法，包括直接结合法、还原胺法、氰基活化法和其他方法。
[0009]优选的，所述的痢疾组合疫苗有选自痢疾菌血清型福氏2a菌和宋内菌的痢疾多糖结合物组合制备而成。
[0010]本专利技术优选的组合疫苗，制备方法如下：其中福氏2a痢疾多糖采用还原胺法制备结合物，宋内氏痢疾多糖采用直接结合法制备结合物。
[0011]本专利技术组合疫苗的制备方法，步骤如下：
[0012](1)福氏2a痢疾多糖采用还原胺法制备得到福氏2a多糖蛋白结合物；
[0013](2)宋内氏痢疾多糖采用带有间隔剂的直接结合法制备得到宋内氏痢疾多糖蛋白结合物；
[0014](3)将福氏2a多糖蛋白结合物和宋内氏痢疾多糖蛋白结合物混合，以适量磷酸铝佐剂吸附，即得疫苗。
[0015]其中，(1)福氏2a多糖蛋白结合物，制备方法如下：
[0016]步骤1：福氏2a痢疾多糖经高碘酸钠氧化，经超滤透析后获得氧化多糖；
[0017]步骤2：氧化多糖与己二酰肼(ADH)衍生，经超滤透析后获得多糖衍生物；
[0018]步骤3：多糖衍生物与载体蛋白在碳二亚胺(EDAC)缩合作用下制备结合物；
[0019]步骤4：结合物经层析纯化、除菌过滤后即为福氏2a多糖蛋白结合物原液。
[0020]优选的，(1)福氏2a多糖蛋白结合物，制备方法如下：
[0021]步骤1：福氏2a痢疾多糖溶解后，加入高碘酸钠至1～10mmol/L，反应1～24 小时，经超滤透析纯化，获得氧化多糖；
[0022]步骤2：氧化多糖与己二酰肼(ADH)混合、加入硼氰化钠，调整pH4.5～6.0 附近，至ADH终浓度为10～80mg/ml、硼氰化钠为2～10mg/ml，室温反应3天，经超滤透析纯化，获得多糖衍生物；
[0023]步骤3：多糖衍生物与蛋白混合，加入碳二亚胺(EDAC)至0.02～0.05mol/L，反应120～240分钟，制备结合物。
[0024]步骤4：结合物经Sepharose 4FF层析纯化，收集V0附近洗脱峰，经除菌过滤后即为福氏2a痢疾多糖蛋白结合物原液。
[0025]其中，(2)宋内氏痢疾多糖蛋白结合物的制备方法如下：
[0026]步骤1：宋内氏痢疾多糖与己二酰肼(ADH)衍生，经超滤透析，获得多糖衍生物；
[0027]步骤2：多糖衍生物与载体蛋白在碳二亚胺(EDAC)缩合作用下制备结合物；
[0028]步骤3：结合物经层析纯化、除菌过滤后即为宋内氏痢疾多糖蛋白结合物原液。
[0029]优选的，(2)宋内氏痢疾多糖蛋白结合物的制备方法如下：
[0030]步骤1：宋内氏痢疾多糖溶解后，加入10～80mg/ml ADH、1～5mg/ml EDAC 混匀，调整pH4.5～5.6附近，室温反应120～240分钟，超滤纯化后获得多糖衍生物。
[0031]步骤2：多糖衍生物与蛋白混合，加入EDAC至0.02～0.05mol/L，反应120～ 240分
钟，制备结合物。
[0032]步骤3：结合物经Sepharose 4FF层析纯化，收集V0附近洗脱峰，经除菌过滤后即为宋内氏痢疾多糖蛋白结合物原液。
[0033]本专利技术所述的多糖蛋白结合物制备方法，其中福氏2a痢疾多糖采用还原胺法制备结合物，已知痢疾O
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双价痢疾结合物组合疫苗的制备方法，其特征在于，组合疫苗是由两种痢疾杆菌的多糖蛋白结合物组合而成，所述结合物为相应的血清型的痢疾多糖与载体蛋白通过选择不同的结合方法制备的多糖蛋白结合物，多糖蛋白结合物原液再与铝佐剂按适当比例吸附后获得痢疾结合疫苗，其中，结合方法为两种或两种以上的结合方法，包括直接结合法、还原胺法、氰基活化法、其他方法，双价痢疾结合物组合疫苗为痢疾杆菌血清型福氏2a菌和宋内菌的痢疾多糖蛋白结合物组合制备而成。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中福氏2a痢疾多糖采用还原胺法制备结合物，宋内氏痢疾多糖采用带有间隔剂的直接结合法制备结合物。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)福氏2a痢疾多糖采用还原胺法制备得到福氏2a多糖蛋白结合物；(2)宋内氏痢疾多糖采用带有间隔剂的直接结合法制备得到宋内氏痢疾多糖蛋白结合物；(3)将福氏2a多糖蛋白结合物和宋内氏痢疾多糖蛋白结合物混合，以适量磷酸铝佐剂吸附，即得疫苗。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，(1)福氏2a多糖蛋白结合物，制备方法如下：步骤1：福氏2a痢疾多糖经高碘酸钠氧化，经超滤透析后获得氧化多糖；步骤2：氧化多糖与己二酰肼(ADH)衍生，经超滤透析后获得多糖衍生物；步骤3：多糖衍生物与载体蛋白在碳二亚胺(EDAC)缩合作用下制备结合物；步骤4：结合物经层析纯化、除菌过滤后即为福氏2a多糖蛋白结合物原液。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，(2)宋内氏痢疾多糖蛋白结合物的制备方法如下：步骤1：宋内氏痢疾多糖与己二酰肼(ADH)衍生，经超滤透析后获得多糖衍生物；步骤2：多糖衍生物与载体蛋白在碳二亚胺(EDAC)缩合作用下制备结合物；步骤3：结合物经层析纯化、除菌过滤后即为宋内氏痢疾多糖蛋白结合物原液。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，(1)福氏2a多糖蛋白结合物，制备方法如下：步骤1：福氏2a痢疾多糖溶解后，加入高碘酸钠至1～10mmol/L，反应1～24小时，经超滤透析纯化，获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗向坤，胡小华，张霁，王瑞峰，林彦彬，胡国伟，王迅，朱卫华，杜琳，
申请(专利权)人：重庆智飞生物制品股份有限公司安徽智飞龙科马生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：