化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法，该方法最少利用1~5个胰岛，可以筛选数十到上百种化合物对葡萄糖刺激胰岛素分泌的作用，也可以用于检测不同疾病动物模型的胰岛功能，所述方法主要包括胰岛培养→胰岛孵育→胰岛素或胰高血糖素测定。该方法成本低、耗时短、使用方便，可以在药物筛选和胰岛生物学研究中得到应用。

【技术实现步骤摘要】
化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法
本专利技术涉及一种化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法。
技术介绍
糖尿病是目前世界范围内最严重的健康问题之一，2015年全球20-79岁的人中有约4.15亿人患糖尿病，另外有3.18亿人糖耐量受损。中国是全球糖尿病患者第一大国，2015年病患人数高达1.096亿人，130万人死于糖尿病及其并发症。据国际糖尿病联盟预测，如果不加干预，2040年全球糖尿病患者将达6.42亿，我国患者数量将上升至1.54亿。糖尿病是由于胰岛素在体内的绝对不足和相对不足而引起的以高血糖为主要特征的疾病，如果病人长期高血糖不加以控制会引发糖尿病心肌病、肾病、视网膜病变及神经病变的发生与发展，严重危害患者的健康和生活。因此，糖尿病发病机制及药物一直是医药学界研究的重点，促进胰岛素分泌是抗糖尿病药物的作用机制之一。胰岛是胰腺的内分泌组织，主要是由胰岛alpha和beta细胞组成的细胞团，散布在胰腺的各处，胰岛产生的胰岛素和胰高血糖素，是机体能量代谢的主要调节激素，特别是针对碳水化合物的代谢调节，如果胰岛素长期分泌不足，会导致糖尿病的发生。目前胰岛功能研究的技术主要包括胰岛灌流和胰岛孵育。胰岛灌流可以得到动态的胰岛素分泌曲线，但耗时长、成本高、技术难度大。传统的方法分离培养的胰岛和功能研究不适用于高通量的研究，限制了胰岛功能研究在疾病机制研究领域及药物研发领域的应用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法，可快速、大批量的检测化合物对胰岛功能的影响。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法，其步骤包括：a、将胰岛置于RPMI1640培养液中培养2~3天；b、取1~5个胰岛置于96孔板中，其中胰岛之间的大小误差不超过20%，加入孵育液，离心，移走上清；c、在胰岛中加入孵育液，在摇床上培养30分钟，离心，移走上清；d、在胰岛中加入刺激液，在摇床上培养30分钟，离心，收集上清液，并测量上清液中的胰岛素分泌水平。优选的，其中刺激液包括对照组刺激液和化合物组刺激液，所述对照组刺激液为在孵育液中加入葡萄糖，化合物组刺激液为在孵育液中加入同样浓度的葡萄糖以及待测化合物；或者对照组刺激液为在孵育液中加入亮氨酸+谷氨酰胺，化合物组刺激液为在孵育液中加入同样浓度的亮氨酸+谷氨酰胺以及待测化合物；根据对照组刺激液和化合物组刺激液培养的胰岛素分泌水平，分析化合物对葡萄糖对胰岛的促胰岛素分泌作用起到促进还是抑制作用，促进或抑制的程度为多少；或者分析化合物对亮氨酸+谷氨酰胺对胰岛的促胰岛素分泌作用起到促进还是抑制作用，促进或抑制的程度为多少；所述刺激液中葡萄糖浓度为0~25mM；或者刺激液中亮氨酸浓度为0~10mM，谷氨酰胺浓度为2mM。优选的，所述孵育液中NaCl的浓度为115mmol/L,NaHCO3的浓度为24mmol/L,KCl的浓度为5mmol/L，MgCl2的浓度为1mmol/L，CaCl2的浓度为2.5mmol/L，HEPES浓度为10mmol/L，溶剂为H2O，调节溶液pH到7.4，再加入0.25%牛血清白蛋白。优选的，步骤a中的培养条件为37℃、5%CO2及95%空气湿度的培养箱。优选的，步骤c和d中的培养条件为37℃、5%CO2培养箱的摇床。本专利技术还公开了一种化合物对胰岛功能（胰岛素及胰高糖素分泌）影响的高通量检测方法，其步骤包括：a、将胰岛置于RPMI1640培养液中培养2~3天；b、取15~25个胰岛置于培养装置中，其中胰岛之间的大小误差不超过20%，加入孵育液，离心，移走上清；c、在胰岛中加入孵育液，在摇床上培养30分钟，离心，移走上清；d、在胰岛中加入刺激液，在摇床上培养30分钟，离心，收集上清液，并测量上清液中的胰岛素及胰高糖素分泌水平。优选的，其中刺激液包括对照组刺激液和化合物组刺激液，所述对照组刺激液为在孵育液中加入甘氨酸及不同浓度葡萄糖，化合物组刺激液为在孵育液中加入同样浓度的甘氨酸及不同浓度葡萄糖以及待测化合物；根据对照组刺激液和化合物组刺激液培养的胰岛素及胰高糖素分泌水平，分析化合物对葡萄糖对胰岛的促胰岛素分泌作用，甘氨酸对胰高糖素刺激分泌作用及葡萄糖对甘氨酸刺激的胰高糖素分泌的抑制作用起到促进还是抑制作用，促进或抑制的程度为多少，所述刺激液中葡萄糖浓度为0～25mmol/L,，甘氨酸的浓度为1mmol/L。优选的，所述孵育液中NaCl的浓度为115mmol/L,NaHCO3的浓度为24mmol/L,KCl的浓度为5mmol/L，MgCl2的浓度为1mmol/L，CaCl2的浓度为2.5mmol/L，HEPES的浓度为10mmol/L，溶剂为H2O，调节溶液pH到7.4，再加入0.25%牛血清白蛋白。优选的，步骤a中的培养条件为37℃、5%CO2及95%空气湿度的培养箱。优选的，步骤c和d中的培养条件为37℃、5%CO2培养箱的摇床。本专利技术的有益效果如下：本专利技术只需要4个小时左右的时间（胰岛实验时间为1小时，激素测定时间为3小时）即可测量出化合物对胰岛分泌水平的影响，胰岛的用量少，只需1~5个胰岛即可测量。如果培养容器选择96孔板的话，可同时进行多个化合物对胰岛分泌水平影响的测量，成本低、耗时短、步骤简单、使用方便，结果的重复性好，在药物筛选和胰岛生物学研究中有广泛应用。附图说明图1.实施例1中一种胰岛功能刺激药物（GSK-J1500nmol/L，H3K27histonedemethylase抑制剂）对葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响图，图中三角形标注的为对照组刺激液培养的胰岛的胰岛素水平分泌图，圆形标注的为化合物组（GSK-J1）刺激液培养的胰岛的胰岛素水平分泌图；图2、实施例2中胰岛功能刺激药物（TAK-875）对葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响图；图3.实施例3中刺激物对小鼠胰岛胰高糖素分泌的影响图。图中方形标注的为基因敲除小鼠的胰高糖素水平分泌图，圆形标注的为野生型小鼠的胰高糖素水平分泌图。具体实施方式实施例1：1.胰岛分离胰岛分离的方法为本领域通用的方法。下为小鼠胰岛分离的过程简述：1）小鼠麻醉后固定于手术板上，打开腹腔，用止血钳闭锁胆管进入十二指肠的入口，之后用5ml注射器及31.5号针头将2mg/ml的胶原酶溶液（溶解在Hanks缓冲液内）注射进入胆管，至胰腺充分充起后停止。2）剥离胰腺，清理掉脂肪及非胰腺组织后，将胰腺转移到50ml离心管内，再倒入3ml的2mg/ml胶原酶溶液，在37℃水浴中震荡4~5分钟。3）震荡结束后，立刻在50ml离心管内加入Hanks缓冲液至50ml，离心（2000转，30秒），移走上清，剩余组织沉淀加入5mlHistopaque-1119溶液，震荡混匀。4）缓慢加入5mlHistopaque-1077溶液,再缓慢本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法，其步骤包括：/na、将胰岛置于RPMI1640培养液中培养2~3天；/nb、 取1~5个胰岛置于多孔板中，其中胰岛之间的大小误差不超过20%，加入孵育液，离心，移走上清；该流程再重复一遍；/nc、在胰岛中加入孵育液，在摇床上孵育30分钟，离心，移走上清；/nd、在胰岛中加入刺激液，在摇床上孵育30分钟，离心，收集上清液，并测量上清液中的胰岛素分泌水平，根据胰岛素分泌水平分析待测化合物对胰岛素分泌的影响。/n

【技术特征摘要】
1.一种化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法，其步骤包括：
a、将胰岛置于RPMI1640培养液中培养2~3天；
b、取1~5个胰岛置于多孔板中，其中胰岛之间的大小误差不超过20%，加入孵育液，离心，移走上清；该流程再重复一遍；
c、在胰岛中加入孵育液，在摇床上孵育30分钟，离心，移走上清；
d、在胰岛中加入刺激液，在摇床上孵育30分钟，离心，收集上清液，并测量上清液中的胰岛素分泌水平，根据胰岛素分泌水平分析待测化合物对胰岛素分泌的影响。


2.根据权利要求1所述的化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法，其特征在于：所述刺激液包括对照组刺激液和化合物组刺激液，所述对照组刺激液为在孵育液中加入设计浓度的葡萄糖，化合物组刺激液为在孵育液中加入同样浓度的葡萄糖以及设计浓度的待测化合物；或者对照组刺激液为在孵育液中加入亮氨酸+谷氨酰胺，化合物组刺激液为在孵育液中加入同样浓度的亮氨酸+谷氨酰胺以及设计浓度的待测化合物，所述刺激液中葡萄糖浓度为0~25mmol/L；或者刺激液中亮氨酸浓度为0~10mmol/L，谷氨酰胺浓度为2mmol/L。


3.根据权利要求1或2所述的化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法，其特征在于：所述孵育液中NaCl的浓度为115mmol/L,NaHCO3的浓度为24mM,KCl的浓度为5mmol/L，MgCl2的浓度为1mmol/L，CaCl2的浓度为2.5mmol/L，HEPES浓度为10mmol/L，溶剂为H2O，调节溶液pH到7.4，再加入0.25%牛血清白蛋白。


4.根据权利要求3中所述的化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法，其特征在于：步骤a中的培养条件为37℃、5%CO2及95%空气湿度的摇床培养箱。


5.根据权利要求4所述的化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法，其特征在于：步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：李长红，顾明星，孟诗，周雪，
申请(专利权)人：南京盛德生物科技研究院有限公司，南京盛德瑞尔医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32