一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法技术

本发明专利技术属于天然生物纳米材料领域，具体涉及一种培养MSC干细胞的HPL培养基及无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法。本发明专利技术提供的培养MSC干细胞的HPL培养基，采用人源性血小板裂解物来代替动物血清FBS用于细胞培养。本发明专利技术提供的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，制备工艺简单、高效、成本低；其外泌体产量比常规2D细胞培养方法高得多，所制备外泌体的抗癌活性也更高，且使用更安全，为MSC干细胞来源生物纳米载药治疗癌症等潜在的临床应用铺垫了良好的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法
本专利技术属于天然生物纳米材料领域，具体涉及一种培养MSC干细胞的HPL培养基及无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)是一类成体干细胞，可从成人骨髓和脂肪等组织或从新生儿附属组织如脐带和胎盘中分离培养而得。MSC细胞易于体外扩增，天然具有肿瘤趋向性，以及抑制肿瘤生长、消炎和保护机体免受损伤的特点，是一种良好的细胞治疗资源。已发现，MSC展现生物活性的主要机制是通过旁分泌途径向细胞外环境释放一类小的细胞外囊泡(EV)，其直径大小在50～130nm，可向靶细胞传输生物活性分子，诸如蛋白质、活性脂和核酸分子(mRNA、miRNA、lncRNA)，影响或调控靶细胞的功能。根据2018国际EV研究协会指南建议，这类小的EV属于细胞通过内体途径产生的外泌体。越来越多的研究表明，MSC来源的EV具有可媲美于MSC细胞本身的治疗活性，潜在地可用于诸多疾病的治疗，包括癌症、心脑血管病、急性肾损伤、肝脏纤维化和创伤愈合等。所以，现在MSC来源的EV已逐渐成为替代MSC本身的无细胞治疗试剂，被称为细胞治疗的第二代(2G)产品。EV制剂替代MSC用于疾病治疗，具有更好的安全性，可操作性更强，易于保存，还可以多重载药实现联合治疗，以及可以进行靶向修饰、免疫逃逸修饰和药物可控释放修饰，具有非常好的应用前景。通常采用贴壁方式培养MSC细胞，使用的培养基是添加10～17％FBS的α-MEM或DF12。这种培养细胞的方式，MSC以单细胞层紧贴在培养容器的底部，可称为二维(2D)培养。而在体内环境中，MSC存在的微环境是三维(3D)的，细胞与细胞外基质(如胶原蛋白纤维或透明胶质酸)紧密结合。已有研究发现，体外3D培养的MSC细胞，其分泌某些治疗性因子，如抗癌活性蛋白或消炎因子的水平更高。众所周知，开发外泌体用于疾病治疗的一个瓶颈就是产量不够高，迫切需要找到提高外泌体产量的方法。已发现低氧培养和饥饿培养等方法可增加MSC细胞的外泌体产量。此外，3D培养环境也有可能增加MSC的外泌体产量。已发现可用于MSC3D培养的支架材料包括胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸和藻元酸钠等。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种培养MSC干细胞的HPL培养基，该HPL培养基采用人源性血小板裂解物(humanplateletlysate，HPL)代替FBS；HPL中含有大量的生长因子，足以支持MSC干细胞的体外生长和扩增，且HPL中含有大量的血纤维蛋白原，在细胞培养过程中可迅速水解为纤维蛋白而形成水凝胶，产生一个3D的培养环境，与含有FBS的培养基相比，该HPL培养基不仅能更好地支持细胞生长和体外扩增，而且HPL含有的血纤维蛋白形成的水凝胶3D环境显著增加了MSC外泌体的产量，且EV携带的TRAIL的表达水平也显著增加，其抗癌效应相应得到增强。本专利技术的另一目的在于提供一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，该方法利用上述HPL培养基，通过3D培养TRAIL基因工程修饰的MSC干细胞(MSCflT)，制得的表达TRAIL的外泌体(EV-T)的产量和抗癌蛋白TRAIL的表达水平均显著高于2D培养来源的EV-T，并且EV-T的生物活性也更高，具有更好的治疗潜力。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种培养MSC干细胞的HPL培养基，包含人源血小板裂解物(HPL)和基础DF-12培养基；其中，人源血小板裂解物(HPL)的含量为5％(v/v)；所述的人源血小板裂解物(HPL)可通过冻融循环法制备；所述的人源血小板裂解物(HPL)的制备方法，包含如下步骤：(1)将人源血小板进行冷冻/解冻处理，并重复操作一次；然后1500g离心10min，收集上清，得到人源血小板裂解液；将血小板裂解液在4℃条件下10000g离心10min，收集上清并过滤，得到人源血小板裂解物(HPL)；所述的冷冻/解冻处理的具体操作优选为：在-80℃下冷冻48h，然后在37℃水浴中融化2h；所述的过滤优选采用0.22μm滤膜过滤；所述的人源血小板裂解物中纤维蛋白原的含量为2.0mg/mL；一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，包含如下步骤：(1)将上述人源血小板裂解物(HPL)和基础培养基混合，得到培养MSC干细胞的HPL培养基；2)将表达TRAIL的病毒转染MSC干细胞，得到TRAIL基因工程化的MSC干细胞(MSCflT)；3)采用上述培养MSC干细胞的HPL培养基对MSCflT进行3D培养，然后分离外泌体；步骤(2)中所述的病毒包括但不限于慢病毒、逆转录病毒和腺病毒等；步骤(2)中所述的MSC干细胞包括但不限于脐带来源间充质干细胞(UC-MSC)、骨髓间充质干细胞(BM-MSC)、脂肪间充质干细胞(AD-MSC)、牙髓间充质干细胞、胎盘和羊水以及羊膜间充质干细胞中的至少一种；步骤(2)中所述的表达TRAIL的病毒，优选通过如下方法制备得到：将TRAIL表达质粒pCCL-CMV-flT与慢病毒包装质粒pCMV-dR8.74和pMD2.G共转染293T细胞，收集细胞培养上清，通过超速离心沉淀病毒，最后将病毒沉淀重新悬浮溶解于PBS溶液，得到表达TRAIL的慢病毒溶液；步骤(2)中所述的转染的具体操作优选为：采用表达TRAIL的慢病毒溶液转染MSC干细胞，并采用终浓度为8μg/mL的polybrene增强转染，孵育6～24h；孵育后将培养基换成含有10％FBS的DMEM新鲜培养基，继续培养2～3天；待细胞长满后，进行增殖传代培养，得到TRAIL基因工程化的MSC干细胞(MSCflT)；所述的表达TRAIL的慢病毒溶液的浓度优选为MOI＝3；所述的孵育时间优选为10h；步骤(3)中所述的分离方法包括但不限于超速离心、外泌体沉淀试剂沉淀、密度梯度离心、超滤离心、PEG-base沉淀法和大小排阻色谱法等中的至少一种。一种高活性外泌体，通过上述制备方法制备得到；所述的高活性外泌体在制备抗癌产品中的应用。本专利技术的原理：为了避免动物血清(FBS)来源蛋白被摄入细胞而造成临床应用中免疫排斥的安全问题，本专利技术采用人源性血小板裂解物(humanplateletlysate，HPL)代替FBS用于细胞培养；其中，HPL中含有大量的生长因子，足以支持MSC干细胞的体外生长和扩增；并且，HPL培养的MSC干细胞已被临床试验证明是安全的，不会引起免疫排斥反应。此外，HPL中含有大量的血纤维蛋白原；本专利技术首次发现，如果在细胞培养时没有预先去除掉血纤维蛋白原，在细胞培养过程中可迅速水解为纤维蛋白而形成水凝胶，产生一个3D的培养环境。本专利技术利用这种新颖的3D基质培养MSC干细胞，以期增加其外泌体分泌和生物活性分子的表达水平，同时确保所制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养MSC干细胞的HPL培养基，其特征在于包含人源血小板裂解物和基础DF-12培养基，其中，人源血小板裂解物的含量为5％(v/v)。/n

【技术特征摘要】
1.一种培养MSC干细胞的HPL培养基，其特征在于包含人源血小板裂解物和基础DF-12培养基，其中，人源血小板裂解物的含量为5％(v/v)。


2.根据权利要求1所述的培养MSC干细胞的HPL培养基，其特征在于：
所述的人源血小板裂解物的制备方法，包含如下步骤：
(1)将人源血小板进行冷冻/解冻处理，并重复操作一次；然后1500g离心10min，收集上清，得到人源血小板裂解液；将血小板裂解液在4℃条件下10000g离心10min，收集上清并过滤，得到人源血小板裂解物。


3.一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)将人源血小板裂解物和基础培养基混合，得到权利要求1或2所述的培养MSC干细胞的HPL培养基；
(2)将表达TRAIL的病毒转染MSC干细胞，得到TRAIL基因工程化的MSC干细胞；
(3)采用上述培养MSC干细胞的HPL培养基对MSCflT进行3D培养，然后分离外泌体。


4.根据权利要求3所述的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的病毒包括但不限于慢病毒、逆转录病毒和腺病毒。


5.根据权利要求3所述的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的MSC干细胞包括但不限于脐带来源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁正强，苏奎，候欢，袁倩，黎淑怡，孙健武，黄超鸿，柯长洪，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44