制备引入外源抗原受体的细胞的方法技术

本文提供了一种制备导入抗原特异性受体基因的细胞的方法，该方法包括将外源TCR或CAR基因引入到材料细胞中，以使所引入的基因在材料细胞的T细胞受体表达控制系统下表达的步骤；以及提供一种用于引入外源抗原受体基因的材料细胞，所述材料细胞在其基因组的TCR基因座中，从上游到下游包括TCR基因座的V区启动子，耐药基因或报告基因，或已知的TCR或CAR基因，TCR基因座的C区增强子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备引入外源抗原受体的细胞的方法
本公开涉及引入了外源性T细胞受体或嵌合抗原受体的细胞。
技术介绍
已经提出了通过使用成熟T细胞的治疗方法，所述成熟T细胞通过引入编码抗原特异性受体(例如疾病特异性T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR))的基因而被转导。特别地，已经批准并临床使用了使用CAR-T细胞或引入了CAR的细胞的治疗方法。CAR-T治疗是一种所谓的自体移植系统，其中源自患者的T细胞用于引入编码CAR的基因。通过逆转录病毒或慢病毒将基因随机引入基因组。当通过这种方法引入基因时，存在损坏正常基因并激活癌症基因的风险。另一方面，已经提出了通过基因组编辑方法敲除在重排的TCR基因座中编码CAR的基因的方法(Nature，543：113，2017)。在这种方法中，引入的基因处于生理TCR表达控制系统的控制之下，以这种方式制备的CAR-T细胞被认为具有更高的功能性。本专利技术人已提出了在多能干细胞中引入TCR的方法(专利文献1)。然后，将引入了TCR基因的多能干细胞分化为T细胞，并用于细胞治疗。MSadelain提出将CAR基因引入多能干细胞(专利文献2和非专利文献1)。迄今为止，还没有报道将编码TCR或CAR的基因引入不是T细胞的细胞的TCR基因座中。T细胞以外的其他细胞中的TCR基因座不会重排。没有关于在未发生基因重排的细胞的TCR基因座中敲除TCR或CAR基因的报道。重组酶介导的盒式交换(Recombinase-mediatedcassetteexchange，RMCE)已知是将基因引入细胞的过程。在该过程中，可以使用具有类似“盒式平台(cassettedeck)”结构的材料细胞。具有“盒式平台结构”的细胞在其基因组中具有特定位点，可以与目的基因或“盒式磁带基因”交换。通过使用重组酶(例如Cre或Flippase)，像交换盒式磁带一样，将外源基因(目的基因)引入宿主细胞。该过程已经被应用于操纵T细胞系(非专利文献2)。没有关于将RMCE应用于T细胞受体基因座的报道。通常，已经将TCR或CAR基因引入成熟T细胞中。一些本专利技术人提出将TCR基因引入多能干细胞中(专利文献3-5)。也已经提出将CAR基因引入多能干细胞中。在那些过程中，通过使用例如慢病毒载体，将TCR或CAR基因随机引入细胞的基因组中。但是，最好在宿主细胞的原始TCR基因座中敲入TCR或CAR基因，以期预期引入的TCR或CAR基因的生理表达模式。实际上，有报道称将CAR基因引入成熟T细胞中的重排TCR基因座中。通常，所有类型的细胞都有TCR基因座。但是，TCR基因重排不在T细胞以外的细胞中发生。仅通过将TCR/CAR基因插入细胞的TCR基因座中，不能在T细胞以外的细胞中表达外源TCR/CAR。尽管期望在细胞治疗中使用各种类型的TCR/CAR基因，但是将每个单个TCR/CAR敲入宿主细胞基因组中的所需基因座将需要大量的时间和成本。引文清单专利文献[PTL1]WO2016/010154[PTL2]WO2014/165707[PTL3]WO2016/010153[PTL4]WO2016/010154[PTL5]WO2016/010155非专利文献[NPL1]Themelietal.，NatBiotechnol.(2013)928-33[NPL2]GongYingetal.，JournalofCellBiology(2015)1481-1489
技术实现思路
本专利技术要解决的问题本申请的一个目的是提供一种有效的方法，以提供稳定表达可用于细胞治疗的外源TCR或CAR基因的细胞。本申请的另一个目的是提供带有空的“盒式平台”的细胞，其可用于通过RMCE引入TCR或CAR基因的盒。解决问题的手段本申请提供了一种制备导入抗原特异性受体基因的细胞的方法，该方法包括将外源TCR或CAR基因引入材料细胞中的步骤，以使所引入的基因在材料细胞的T细胞受体表达控制系统下表达。在一个方面，本申请提供了一种制备细胞的方法，所述细胞中引入了编码抗原特异性受体的基因，所述方法包括以下步骤：将包括外源TCR或CAR基因的基因引入到材料细胞中，从而将外源基因引入TCR基因座的C区增强子和V区启动子之间，使得C区增强子和V区启动子彼此足够靠近，以使TCR表达控制系统表达插入基因。在另一个方面，本申请提供了一种制备细胞的方法，所述细胞中引入了编码抗原特异性受体的基因，该方法包括以下步骤：从上游到下游依次将基因，外源V区启动子基因和包括外源TCR或CAR基因的基因，引入材料细胞中TCR基因座的C区增强子的上游，使得引入的V区启动子和C区增强子彼此足够靠近，以使TCR表达控制系统表达插入基因。在另一方面，本申请提供了一种制备细胞的方法，所述细胞中引入了编码抗原特异性受体的基因，所述方法包括以下步骤：将从上游到下游依次包含外源TCR或CAR基因和外源C区增强子的基因引入材料细胞的TCR基因座中V区启动子的上游，使得V区启动子和引入的C区增强子彼此足够靠近，以使TCR表达控制系统表达插入基因。本申请还提供了用于抗原受体转导的材料细胞，其中在材料细胞基因组中的TCR基因座中从上游到下游依次包含V区启动子，被第一重组酶靶序列夹住的第一耐药基因，第二耐药基因和第二重组酶靶序列，以及C区增强子。本申请进一步提供了一种制备用于细胞治疗的细胞的方法，其包括诱导已通过本申请的方法将外源抗原受体基因引入TCR基因座的材料细胞分化为T细胞的步骤。专利技术效果本申请的方法使得有可能制备高度通用的细胞，所述细胞可用于使用表达TCR和CAR的细胞进行细胞治疗。另外，可以容易地将外源TCR基因或CAR基因引入用于抗原受体转导的材料细胞中，并确保TCR/CAR基因在最终产物中的稳定表达。结果，可以有效且容易地产生表达外源TCR或CAR的免疫治疗细胞。附图说明[图1]显示了TCRαβ的示意图和TCRβ基因座的基因重排的示意图。在图中，P表示启动子，E表示增强子。在V-DJ重排中，重组使增强子和启动子靠得更近，并且表达了TCR。[图2]显示本申请方法的概念的示意图。在这些图中，P代表启动子，E代表增强子。[图3-1]显示实施例的耐药基因盒载体的构建过程的示意图。使用了带有小鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)基因(pPGK)的启动子的pBRBII-AscI_FRTPGKpacΔtkpA_AscI载体。(A)中的引物1和引物2具有与序列1和序列2相同的序列，它们分别是(B)中pBRMC1DTApA载体的限制酶切割位点5′侧和3′侧的DNA序列。所得的PCR产物在两端具有与pBRMC1DTApA载体中的序列-1和序列-2相同的序列。通过Gibson组装法，将载体和PCR产物通过相同的序列组合以形成(C)中的结构。[图3-2]分别从(E)的PB-flox(CAG-mCherry-IH；TRE3G-miR-155-LacZa)载体和(F)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备导入抗原特异性受体基因的细胞的方法，该方法包括将外源TCR或CAR基因引入到材料细胞中，以使所引入的基因在材料细胞的T细胞受体表达控制系统下表达的步骤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180726 JP 2018-1405231.一种制备导入抗原特异性受体基因的细胞的方法，该方法包括将外源TCR或CAR基因引入到材料细胞中，以使所引入的基因在材料细胞的T细胞受体表达控制系统下表达的步骤。


2.根据权利要求1的方法，其中所述材料细胞的基因组中的T细胞受体基因尚未重排。


3.根据权利要求1或2的方法，其中所述材料细胞是多能干细胞。


4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述外源TCR或CAR基因通过重组酶-介导盒式交换(RMCE)方法或基因组编辑方法引入所述材料细胞中。


5.一种用于引入外源抗原受体基因的材料细胞，所述材料细胞在其基因组的TCR基因座中，从上游到下游包括TCR基因座的V区启动子，耐药基因或报告基因，或已知的TCR或CAR基因，TCR基因座的C区增强子。


6.根据权利要求5的用于引入外源抗原受体基因的材料细胞，其包含TCR基因座中的V区启动子与耐药基因或报告基因或已知的TCR或CAR基因之间的重组酶的靶序列(i)，以及耐药基因或报告基因或外源TCR或CAR基因与TCR基因座中的C区增强子之间的重组酶的靶序列(ii)。


7.根据权利要求5或6的用于引入外源抗原受体基因的材料细胞，其中所述细胞具有已知的TCR或CAR基因。


8.一种用于引入外源抗原受体基因的材料细胞，所述材料细胞在其基因组的TCR基因座中，从上游到下游包括TCR基因座的V区启动子，耐药基因或报告基因，或已知的TCR或CAR基因，第一重组酶的靶序列(i)，可在材料细胞中表达的启动子，被连接以可在材料细胞中表达的启动子序列下表达的第一耐药基因，第一重组酶的不同于靶序列(i)的靶序列(ii)，第二耐药基因，第二重组酶的靶序列和TCR基因座的C区增强子。


9.根据权利要求5至8中任一项的材料细胞，其中所述材料细胞中的TCR基因座是所述材料细胞中的TCRα或TCRβ链。


10.根据权利要求9的材料细胞，其中除了引入了耐药基因或报告基因或外源已知的TCR或CAR基因的TCR链以外，所述材料细胞中的TCRα和TCRβ链是有缺陷的。


11.根据权利要求5-10中任一项的材料细胞，其中所述材料细胞是多能干细胞。


12.一种制备根据权利要求8-11中任一项的材料细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)制备包含耐药基因盒的载体，所述载体从上游到下游依次包含TCR基因座的V区启动子序列，第一重组酶的靶序列(i)，可在所述材料细胞中表达的启动子序列，被连接以在可在所述材料细胞中表达的启动子序列下表达的第一耐药基因，第一重组酶的不同于靶序列(i)的靶序列(ii)和第二耐药基因；
(b)将步骤(a)中制备的载体敲入材料细胞基因组中的TCR基因座中；和
(c)选择成功敲入耐药基因盒的细胞，包括在第一耐药基因具有耐性的药物存在下培养步骤(b)中获得的细胞。


13.根据权利要求12的方法，其中在步骤(b)中，将步骤(a)中制备的载体敲入到非重排TCR基因座中V区启动子下游的位点，从而使耐药基因盒被替换为V区启动子下游的V区和DJ区。


14.根据权利要求12的方法，其中步骤(a)中制备的载体进一步包含在最上游位点的TCR基因座中的V区启动子，并且在步骤(b)中，步骤(a)中制备的载体被敲入材料细胞基因组中TCR基因座的DJ区。


15.根据权利要求12的方法，其中步骤(a)中制备的载体进一步包含在最...

【专利技术属性】
技术研发人员：河本宏，县保年，永野诚治，寺田晃士，增田乔子，
申请(专利权)人：国立大学法人京都大学，国立大学法人滋贺医科大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP