【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法相关申请的交叉引用本申请要求2018年8月31日提交的美国临时申请62/726,155；要求2018年11月30日提交的美国临时申请62/773,679；以及要求2019年6月7日提交的美国临时申请62/858,482的优先权，其每个的全部内容通过引用以其整体结合在此。序列表本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用以其全文并入的序列表。所述ASCII副本创建于2019年8月16日，名称为N2067-7153WO_SL.txt并且大小为260,532字节。
本专利技术总体上涉及制备经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法，以及包含所述免疫效应细胞的组合物。
技术介绍
使用T细胞(特别是用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞)的过继性细胞转移(ACT)疗法在若干个血液癌症试验中显示出前景。目前，基因修饰的T细胞的制造是一个复杂的过程。存在对改善表达CAR的细胞治疗产品的产生、提高产品质量和使产品的治疗功效最大化的方法和程序的需求。
技术实现思路
本披露内容关于制备经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法，以及使用此类方法产生的组合物。还披露了使用此类组合物用于治疗受试者的疾病(例如癌症)的方法。在一些实施例中，本专利技术的特征在于制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)群体的方法，所述方法包括：(i)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻或新鲜的白细胞单...
【技术保护点】
1.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)群体的方法，所述方法包括：/n(i)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或与刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触(例如结合)；/n(ii)使所述细胞(例如T细胞)群体与编码所述CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含所述核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，和/n(iii)收获所述细胞(例如T细胞)群体用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制所述细胞群体)或施用，其中：/n(a)步骤(ii)与步骤(i)一起进行或在步骤(i)开始后不晚于20小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时进行，并且/n步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于30(例如26)小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于24小时进行，/n(b)步骤(ii)与步骤(i)一起进行或在步骤(i)开始后不晚于20小...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180831 US 62/726,155;20181130 US 62/773,679;20191.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)群体的方法，所述方法包括：
(i)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或与刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触(例如结合)；
(ii)使所述细胞(例如T细胞)群体与编码所述CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含所述核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，和
(iii)收获所述细胞(例如T细胞)群体用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制所述细胞群体)或施用，其中：
(a)步骤(ii)与步骤(i)一起进行或在步骤(i)开始后不晚于20小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时进行，并且
步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于30(例如26)小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于24小时进行，
(b)步骤(ii)与步骤(i)一起进行或在步骤(i)开始后不晚于20小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时进行，并且
步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时进行，例如在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时进行，或
(c)例如，如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％；
任选地其中步骤(ii)中的核酸分子在病毒载体上，任选地其中步骤(ii)中的核酸分子是病毒载体上的RNA分子，任选地其中步骤(ii)包括用病毒载体转导所述细胞(例如T细胞)群体，所述病毒载体包含编码所述CAR的核酸分子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3(例如抗CD3抗体)的药剂，并且其中所述刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226，或其任何组合的药剂；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂或所述刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂或所述刺激共刺激分子的药剂不包含珠；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂包含抗CD3抗体，并且所述刺激共刺激分子的药剂包含抗CD28抗体；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD3抗体，并且所述刺激共刺激分子的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD28抗体；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂和所述刺激共刺激分子的药剂包含T细胞TransActTM。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中与通过其他类似方法制备的细胞相比，步骤(i)增加来自步骤(iii)的细胞群体中表达CAR的细胞的百分比，例如来自步骤(iii)的细胞群体显示更高百分比的表达CAR的细胞(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％更高)，所述其他类似方法不包括步骤(i)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中
(a)来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相同或相差不超过5％或10％；
(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比增加例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；
(c)所述细胞群体中表达CAR的初始T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比在步骤(ii)持续时间的过程中增加，例如在步骤(ii)开始后的18-24小时之间增加例如至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％；或
(d)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比不降低，或降低不超过5％或10％。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中
(a)与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的更高百分比(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(b)与通过其他类似方法制备的细胞中初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍更高)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(c)与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的初始T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的初始T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少4、6、8、10、或12倍更高)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(d)与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的更高的百分比(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天；
(e)与通过其他类似方法制备的细胞中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍更高)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天；或
(f)与通过其他类似方法制备的细胞中表达CAR的初始T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的初始T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少4、6、8、10、或12倍更高)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中
(a)来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞的百分比相同或相差不超过5％或10％；
(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％；
(c)在步骤(ii)持续时间的过程中表达CAR的中枢记忆T细胞，例如表达CAR的CCR7+CD45RO+细胞的百分比降低，例如在步骤(ii)开始后的18-24小时之间降低例如至少8％、10％、12％、14％、16％、18％、或20％；或
(d)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比不增加或增加不超过5％或10％。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中
(a)与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞更低的百分比(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(b)与在通过其他类似方法制备的细胞中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比更低(例如至少20％、30％、40％、或50％更低)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(c)与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的中枢记忆T细胞，例如表达CAR的CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中表达CAR的中枢记忆T细胞，例如表达CAR的CCR7+CD45RO+T细胞的百分比更低(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(d)与通过其他类似方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞的更低百分比(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天；
(e)与通过其他类似方法制备的细胞中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，如CCR7+CD45RO+T细胞的百分比更低(例如至少20％、30％、40％、或50％更低)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天；或
(f)与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的中枢记忆T细胞，例如表达CAR的CCR7+CD45RO+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的中枢记忆T细胞，例如表达CAR的CCR7+CD45RO+T细胞的百分比更低(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中
(a)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比增加；
(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比增加；
(c)与通过其他类似方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比更高，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或
(d)与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比更高，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；
(e)与通过其他类似方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比更高，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天；或
(f)与通过其他类似方法制备的细胞中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的表达CAR的干细胞记忆T细胞，例如表达CAR的CD45RA+CD95+IL-2受体β+CCR7+CD62L+T细胞的百分比更高，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中
(a)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％；
(b)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与以下的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)相比更低(例如，至少低约100％、150％、200％、250％、或300％)：
通过其他类似方法制备的细胞，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如，在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行，或
通过其他类似方法制备的细胞，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如，持续5、6、7、8或9天；
(c)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％；
(d)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与以下的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)相比更低(例如，至少低约50％、100％、125％、150％、或175％)：
通过其他类似方法制备的细胞，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如，在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行，或
通过其他类似方法制备的细胞，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如，持续5、6、7、8或9天；
(e)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％；
(f)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与以下的中位数基因集评分(向下干细胞性)相比更低(例如，至少低约50％、100％、或125％)：
通过其他类似方法制备的细胞，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如，在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行，或
通过其他类似方法制备的细胞，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如，持续5、6、7、8或9天；
(g)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％；
(h)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与以下的中位数基因集评分(向上缺氧)相比更低(例如，至少低约40％、50％、60％、70％、或80％)：
通过其他类似方法制备的细胞，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如，在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行，或
通过其他类似方法制备的细胞，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如，持续5、6、7、8或9天；
(j)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％；或
(k)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与以下的中位数基因集评分(向上自噬)相比更低(例如，至少低约20％、30％、或40％)：
通过其他类似方法制备的细胞，在所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如，在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行，或
通过其他类似方法制备的细胞，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如，持续5、6、7、8或9天。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中例如如使用在实例8中结合图29C-29D描述的方法进行评估，与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天，来自步骤(iii)的细胞群体在与表达由CAR识别的抗原的细胞一起孵育后，以更高的水平(例如至少2、4、6、8、10、12、或14倍更高)分泌IL-2。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天，来自步骤(iii)的细胞群体在被体内施用后持续更长时间或在更高水平上扩增(例如如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法中步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行；或与通过其他类似方法制备的细胞相比，所述其他类似方法进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体持续超过3天，例如持续5、6、7、8、或9天，来自步骤(iii)的细胞群体在被体内施用后显示出更强的抗肿瘤活性(例如在低剂量下具有更强的抗肿瘤活性，例如不超过0.15x106、0.2x106、0.25x106、或0.3x106个表达CAR的活细胞的剂量)。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％，任选地其中来自步骤(iii)的细胞群体中的活细胞数目较步骤(i)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中与在步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增少于2小时，例如少于1或1.5小时。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在包含IL-2、IL-15(例如hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-7、IL-21、IL-6(例如IL-6/sIL-6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂，或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在包含血清替代物的无血清细胞培养基中进行。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述血清替代物是CTSTM免疫细胞血清替代物(ICSR)。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(i)之前：
(iv)(任选地)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的新鲜白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如新鲜全血产物、新鲜骨髓产物、或新鲜肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜产物))，和
(v)从新鲜白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如新鲜全血产物、新鲜骨髓产物、或新鲜肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，如CD8+和/或CD4+T细胞)群体，任选地其中：
步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时进行，或
例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。
19.如权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(i)之前：接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的从白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如从全血、骨髓、或肿瘤或器官活检物或摘除物(例如胸腺切除术)中分离的冷冻保存的T细胞)中分离的冷冻保存的T细胞。
20.如权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(i)之前：
(iv)(任选地)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))，和
(v)从冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+T细胞)群体，任选地其中：
步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时进行，或
例如如通过活细胞数目进行评估，与在步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，所述方法还包括步骤(vi)：
将来自步骤(iii)的细胞群体的一部分培养至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超过7天，并且测量在所述部分中的CAR表达水平(例如测量所述部分中表达CAR的活细胞的百分比)，任选地其中：
步骤(iii)包括收获和冷冻所述细胞(例如T细胞)群体，并且步骤(vi)包括将来自步骤(iii)的细胞群体的一部分解冻，将所述部分培养至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超过7天，并且测量所述部分中的CAR表达水平(例如测量所述部分中表达CAR的活细胞的百分比)。
22.一种制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)群体的方法，所述方法包括：
(1)使细胞(例如T细胞，如从冷冻的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与细胞因子接触，所述细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6，或其组合；
(2)使所述细胞(例如T细胞)群体与编码所述CAR的核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含所述核酸分子的细胞(例如T细胞)群体；和
(3)收获所述细胞(例如T细胞)群体用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制所述细胞群体)或施用，其中：
(a)步骤(2)与步骤(1)一起进行或在步骤(1)开始后不晚于5小时进行，例如在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时进行，并且
步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时进行，例如...
【专利技术属性】
技术研发人员：L·特雷纳，M·R·格林内，J·布罗格顿，B·恩格斯，G·德拉诺夫，O·考德拉斯，H·里姆，A·索霍尼，E·D·普拉蒂科，A·哈克，A·阿布朱布，T·弗莱明，L·黄，C·洪，J·布兰肯希普，B·霍姆伯格，C·张，D·布，A·普赖斯，X·朱，A·斯泰因，A·邦达扎，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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