靶向GPC3的CAR-NK细胞及其制备方法和应用技术

一种靶向GPC3的CAR‑NK细胞，其嵌合抗原受体结构为：GC33‑NKP44TM‑CD3ζ‑CD244‑DNAM1‑DAP10。所述靶向GPC3的CAR‑NK细胞的制备方法：以GC33作为scFv序列；选取CD3ζ、CD244、DNAM1、DAP10、DAP12的胞内段活化结构域串联，作为CAR的胞内段结构域；将NKp44跨膜区与胞浆区含ITAM基序且带有负电荷的DAP12结合，进而介导下游信号转导；去除胞内段结构域DAP12；将CD3ζ与NKp44跨膜区直接连接，以NK‑92细胞系为载体建系。该CAR‑NK细胞中CAR结构更加简单，效果更优，能够在预防或治疗肝癌药物中进行应用，同时也保证了临床使用的安全。

【技术实现步骤摘要】
靶向GPC3的CAR-NK细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及抗体药物的
，更具体地说涉及一种靶向GPC3的CAR-NK细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤是严重威胁人类健康的恶性疾病，而肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康，有研究显示，肝癌的发病率在恶性肿瘤中排名世界第5位，死亡率则位居第3位。在中国，由于存在较为严重的乙型肝炎病毒（HBV）感染等致癌风险因素，肝癌的发病率和死亡率态势尤为严峻，每年有超过10万人死于肝癌及其并发症。尽管医学工作者对肝癌进行了较为深入的研究，并开展了大量的临床实践活动，先后提出了诸如肝移植、肿瘤切除及非切除性局部疗法如肝动脉化疗栓塞等治疗方法和手段，但是仍然难以有效攻克该疾病，尤其是晚期患者难以进行手术治疗，死亡率更高。目前的常规疗法，如手术切除，化学药物疗法，放射疗法等副作用大，严重影响患者的生活质量。因此，临床上迫切需要开发新型的肿瘤治疗手段，以便满足患者的需求。嵌合抗原受体（CAR）是基因工程改造的具有特异靶向性的生物大分子，可以在细胞表面上表达来实现细胞的体内靶向，最典型的载体细胞是T细胞和NK细胞。CAR通常含有免疫球蛋白的单链可变区片段（scFv），特异性识别靶细胞上的抗原，进而通过细胞内信号传导结构域活化细胞功能。在NK-92细胞系或原代NK细胞上表达CAR，可以特异性靶向杀伤实体瘤和血液系统肿瘤。由于噬菌体展示文库技术、核糖体展示技术、SELEX技术和纳米抗体技术的日益成熟，目前针对多种肿瘤抗原和肿瘤相关抗原开发出了特异性CAR；目前多种基于CAR的过继性免疫治疗已经广泛应用于临床实践，用于靶向各种实体肿瘤和血液恶性肿瘤。相比于T细胞“hugtodie”的模式，NK细胞“kisstodie”的杀伤模式对scFv亲和力要求更低，具有更大的抗体选择范围；且NK细胞几乎不引起GVHD，成熟NK在体内寿命一般只有7~10天，因此近年来已将CAR的载体细胞从T细胞扩展到NK细胞。但是，使用原代NK细胞构建CAR-NK存在诸多瓶颈：原代存在转染效率低下，且体外扩增能力有限；肿瘤患者体内NK细胞常常功能受损，无法发挥足够的细胞毒活性；使用异体NK细胞则需要严格去除T细胞，防止GVHD发生。基于永生化NK细胞系开发的CAR-NK疗法逐渐成为主流，但目前针对NK细胞CAR的结构改造尚属空白。
技术实现思路
本专利技术克服了现有技术中的不足，提供了一种靶向GPC3的CAR-NK细胞及其制备方法和应用。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。本专利技术的靶向GPC3的CAR-NK细胞，其嵌合抗原受体结构为：GC33-NKP44TM-CD3ζ-CD244-DNAM1-DAP10。本专利技术的靶向GPC3的CAR-NK细胞的制备方法：以GC33作为scFv序列；选取CD3ζ、CD244、DNAM1、DAP10、DAP12的胞内段活化结构域串联，作为CAR的胞内段结构域；将NKp44跨膜区与胞浆区含ITAM基序且带有负电荷的DAP12结合，进而介导下游信号转导；去除胞内段结构域DAP12；将CD3ζ与NKp44跨膜区直接连接，以NK-92细胞系为载体建系。在CAR-NK细胞中引入自杀基因AP1903-induced-Caspase9。本专利技术的靶向GPC3的CAR-NK细胞在预防或治疗肝癌药物中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术对胞内段、跨膜区都进行了相应的优化，相比T-CAR，CAR中激酶Fyn的磷酸化水平显著上调，进而介导了PLC-γ1和PLC-γ2的活化；CAR可上调Syk磷酸化水平，介导更强的Vav和ERK1/2的活化；CAR可促进了IKKα/β的活化，进而激活IκB，从而促进了p65的磷酸化；CAR也可轻度促进了PI-3Kp85亚基的活化，进而介导了AKT途径的活化增强。附图说明图1为NK-92、CAR和NKp44突变细胞系与HepG2细胞相互作用30min后，Co-IP检测DAP12与嵌合抗原受体间的相互作用示意图；图2为NK-92、CAR和NKp44突变细胞系与HepG2细胞相互作用30min后，Western-Blot检测相关信号通路活化示意图；图3为NK-92、CAR和CD3ζ突变细胞系与HepG2细胞相互作用30min后，Western-Blot检测相关信号通路活化示意图。图4为Western-Blot检测CAR的表达与内参表达NK-92、CAR和CD244突变细胞系与HepG2细胞相互作用30min后，Western-Blot检测相关信号通路活化示意图；图5为NK-92、CAR和DNAM1突变细胞系与HepG2细胞相互作用30min后，Western-Blot检测相关信号通路活化示意图；图6为NK-92、CAR和DAP10突变细胞系与HepG2细胞相互作用30min后，Western-Blot检测相关信号通路活化示意图；图7为NK-92、CAR和全结构域突变细胞系与HepG2细胞相互作用30min后，Western-Blot检测相关信号通路活化；图8为活体成像展示GC33-CAR-NK92及NK-92对肝内HepG2肿瘤的抑制效果示意图；图9为活体成像展示GC33-CAR-NK92及NK-92对肝内Hep3B肿瘤的抑制效果示意图。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明。本专利技术的靶向GPC3的CAR-NK细胞，其嵌合抗原受体结构为：GC33-NKP44TM-CD3ζ-CD244-DNAM1-DAP10。NKp44跨膜区富含带有正电荷的赖氨酸，可与接头蛋白DAP12结合，进而介导Syk、Fyn下游信号转导。胞内段由除最重要的CD3ζ胞内段外，还包括CD244、DNAM1和DAP10组成。DAP10不含ITAM基序而含有YxxM基序，可以活化PI-3激酶亚单位p85，进而活化AKT信号通路；CD244含有含有4个重复的ITSM，可与SAP结合激活Fyn-PLC信号途径，也可活化NFκB信号途径IFN-γ产生；DNAM1属于激活共受体，激活信号不足时DNAM1可以进一步提高NK细胞的杀伤活力，可以及一步提高NK细胞的杀伤活性。本专利技术的靶向GPC3的CAR-NK细胞的制备方法：以GC33作为scFv序列；选取CD3ζ、CD244、DNAM1、DAP10、DAP12的胞内段活化结构域串联，作为CAR的胞内段结构域；将NKp44跨膜区与胞浆区含ITAM基序且带有负电荷的DAP12结合，进而介导下游信号转导；去除胞内段结构域DAP12；将CD3ζ与NKp44跨膜区直接连接，以NK-92细胞系为载体建系。在稳定建系的anti-GPC3CAR-NK细胞中引入自杀基因AP1903-induced-Caspase9，进一步提高安全性，形成可用于临床治疗的稳定细胞系。CAR所使用的经典载体为pRRLSIN.cPPT.EF-1α-GFP.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向GPC3的CAR-NK细胞，其嵌合抗原受体结构为：GC33-NKP44

【技术特征摘要】
1.一种靶向GPC3的CAR-NK细胞，其嵌合抗原受体结构为：GC33-NKP44TM-CD3ζ-CD244-DNAM1-DAP10。


2.一种权利要求1所述靶向GPC3的CAR-NK细胞的制备方法：以GC33作为scFv序列；选取CD3ζ、CD244、DNAM1、DAP10、DAP12的胞内段活化结构域串联，作为CAR的胞内段结构域；将NKp44跨膜区与胞浆区含ITAM基序且带有负电荷的DA...

【专利技术属性】
技术研发人员：王俊捷，贡波，
申请(专利权)人：梅奥浙江细胞工程有限责任公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33