一种CHO细胞组合糖类补料培养基制造技术

一种用于CHO细胞培养的组合糖类补料培养基以及鉴于温度变化CHO细胞的培养基添加方法，培养过程中采用补料培养基在不同培养温度节点添加，温度节点依次为30℃‑34℃‑37℃‑34℃‑32℃，补料培养基1‑5的糖类浓度和组合经过优化选择，所述方法可有效提高外源蛋白的提高。

【技术实现步骤摘要】
一种CHO细胞组合糖类补料培养基
本专利技术涉及生物
，具体属于CHO细胞培养基领域。
技术介绍
中国仓鼠卵巢细胞（CHO）已被广泛的用于治疗性抗体的商业生产，随着对治疗性抗体需求的不断激增，CHO细胞使用的普遍性会持续存在。通过动物细胞培养产生基因工程外源蛋白是获得治疗目的的单克隆抗体的常用方法，但是由于其表达量低于原核和酵母表达系统，因此提高外源基因在CHO细胞中的表达效率十分重要。优化培养基是提高细胞活性，激活表达通路的重要方式。当前针对CHO细胞无血清培养基的研究，主要方法是在基础培养基如DMEM/F12的基础上，添加蛋白水解物，胰岛素、转铁蛋白、生长因子、维生素、脂类、微量元素等。现有技术中已有多种培养基优化的研究基础，以优化培养基组分、添加剂、补料、浓度等为几个主要研究方向，其中，培养温度变化是提高外源蛋白表达的重要方式，US20170356022A1发现在指数生长极端之后将生产培养物冷却到30-33℃的温度T生产，低于细胞系通常培养的温度，可以提高目的蛋白的稳定性；CN107974432A，发现在培养CHO细胞株表达猪瘟E2蛋白时，可在逐级放大培养过程中，初期采用常规温度，恒定期后开始温度和pH下调，可提高蛋白产率；VN10008813000B发现在培养液达到最高细胞密度的20-80%时降低温度，可降低CHO细胞培养液中乳酸和铵的浓度；US5,705,364描述了在链烷酸存在下控制温度和渗透压控制哺乳动物细胞CHO中产生的糖蛋白中唾液酸含量的方法；US20030190710A1提供了一种使用CHO细胞表达单克隆抗体中利用温度和渗透压变化控制IgG非糖基化重链NGHC的方法。然而上述现有技术中，均没有体现温度变化和糖浓度的关系，现有技术中对于糖浓度变化主要在于营养补充剂中一个简单的提高性补偿，容易产生较多副产物不利于细胞状态。基于温度变化节点与不同糖类组合的关联性尚未见有关报道。
技术实现思路
根据现有技术存在的问题，专利技术人意在提供一种随温度变化在不同节点添加不同糖类的培养基和添加方法。对于糖的选择，现有技术中一般而言以葡萄糖为主，偶有采用其他糖类，但也没有与表达量变化产生明显关联，而温度变化也仅限于一个生产温度和细胞培养温度的两类温度的转变关系。然而，专利技术人意外发现温度变化与不同的糖浓度变化存在关联性，由于不同种类的糖可参与外源蛋白表达通路的激活，这种关联性可以映射到外源蛋白表达量的提高，尤其是提高抗体的浓度以及提高其活性，并提高蛋白稳定性。培养温度随着CHO细胞培养时间的推移，按一定速率进行阶段性升温，以及一定速率阶段性下降，配合不同糖类的添加，是本专利技术的主要构思。将现有技术中已知的糖根据分子大小进行分类：单糖：葡萄糖，半乳糖，核糖，果糖，木糖二糖：麦芽糖，麦芽酮糖，异麦芽糖，甘露二糖，纤维二糖，黑曲霉二糖多糖：葡聚糖，纤维素，淀粉，糖原，支链淀粉，凝胶多糖，香菇多糖，酵母多糖，右旋糖酐。培养温度对于细胞的生长有显著的影响，较低的培养温度不利于细胞增殖，细胞的比生长速度随着培养温度的降低而降低，特别是低于30℃时细胞生长受到较大的抑制，然而较低的培养温度对细胞维持和外源蛋白的稳定性维持有利，也能够明显延长培养周期。因此专利技术人根据现有技术选择CHO细胞培养温度范围：30℃-37℃，并意外发现随着温度的一定速度的阶段性提升后再进行阶段性降低维持，对于外源蛋白表达有着明显的影响，并且，伴随每个温度变化节点添加糖类组合，可达到协同增效的作用。根据温度变化阶段需要，设计补料1-5五套营养补料培养基，分别于特定的温度节点变化时添加，用于表达外源蛋白的工程化载体转染后进行营养补料。通过大量基于响应面、全因子实验、Box-Behnken等多因素实验设计，获得培养基补料最优温度、添加时间变化模趋势如表1所示，其中从30℃提升到33℃的提升方式为：30℃12h，31℃12h，32℃12h，33℃12h；从34℃提升到36℃的提升方式为：34℃12h,35℃10h,36℃10h；从37℃降低到35℃的下降方式为：37℃13h，36℃13h，35℃14h；从34℃降低到33℃的下降方式为：34℃10h，33℃10h。表1补料培养基添加培养基添加时培养温度调整添加时间培养时段补料130℃0-48h启动期补料234℃48-80h对数增长期补料337℃80-120h对数增长期补料434℃120h-140h恒定期补料532℃140h代谢产物积累期根据单糖、二糖、多糖中多种糖类进行组合，以外源蛋白表达量、抗体活性等为筛选标准，获得糖类以温度为变化标准的补料培养基成份。表2葡萄糖组合补料培养基（单位mg/L）补料1补料2补料3补料4补料5　对比例130℃34℃37℃34℃32℃葡萄糖10003000800030002000半乳糖2005003000800600麦芽糖5001000200016001500甘露二糖5005005008001000葡聚糖15001800200020002000淀粉800700600500400对比例2葡萄糖10003000800030002000核糖2005001000800800麦芽糖5001000200016001500纤维二糖200300400300200葡聚糖15001800200020002000纤维素500500400400300对比例3半乳糖2005003000800600果糖20001800160015001400麦芽酮糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CHO细胞培养方法，其特征在于：培养过程中采用补料培养基在不同培养温度节点添加，所述温度节点依次为30℃-34℃-37℃-34℃-32℃，其中培养基中的糖类选自如下糖类中的一种或多种，单糖：葡萄糖，半乳糖，核糖，果糖，木糖；二糖：麦芽糖，麦芽酮糖，异麦芽糖，甘露二糖，纤维二糖，黑曲霉二糖；多糖：葡聚糖，纤维素，淀粉，糖原，支链淀粉，凝胶多糖，香菇多糖，酵母多糖，右旋糖酐。/n

【技术特征摘要】
1.一种CHO细胞培养方法，其特征在于：培养过程中采用补料培养基在不同培养温度节点添加，所述温度节点依次为30℃-34℃-37℃-34℃-32℃，其中培养基中的糖类选自如下糖类中的一种或多种，单糖：葡萄糖，半乳糖，核糖，果糖，木糖；二糖：麦芽糖，麦芽酮糖，异麦芽糖，甘露二糖，纤维二糖，黑曲霉二糖；多糖：葡聚糖，纤维素，淀粉，糖原，支链淀粉，凝胶多糖，香菇多糖，酵母多糖，右旋糖酐。


2.根据权利要求1所述的CHO细胞培养方法，所述培养过程的温度变化节点位于特定的培养时间，0-48h培养温度为30℃，48-80h培养温度为34℃，80-120h培养温度为37℃，120h-140h培养温度为34℃，140h-336h培养温度为32℃。


3.根据权利要求2所述的CHO细胞培养方法，所述的温度变化方式为，从30℃提升到33℃的提升方式为：30℃12h，31℃12h，32℃12h，33℃12h；从34℃提升到36℃的提升方式为：34℃12h，35℃10h，36℃10h；从37℃降低到35℃的下降方式为：37℃13h，36℃13h，35℃14h；从34℃降低到33℃的下降方式为：34℃10h，33℃10h。


4.根据权利要求3所述的CHO细胞培养方法，所述的补料培养基1-5中的糖的种类和浓度是不同的，所述添加方式为（单位mg/L）：













补料1
补料2
补料3
补料4
补料5


　对比例1
30℃
34℃
37℃
34℃
32℃


葡萄糖
1000
3000
8000
3000
2000


半乳糖
200
500
3000
800
600


麦芽糖
500
1000
2000
1600
1500


甘露二糖
500
500
500
800
1000


葡聚糖
1500
1800
2000
2000
2000


淀粉
800
700
600
500
400


对比例2







葡萄糖
1000
3000
8000
3000
2000


核糖
200
500
1000
800
800


麦芽糖
500
1000
2000
1600
1500


纤维二糖
200
300
400
300
200


葡聚糖
1500
1800
2000
2000
2000


纤维素
500
500
400
400
300


对比例3







半乳糖
200
500
3000
800
600


果糖
2000
1800
1600
1500
1400


麦芽酮糖
100
400
600
500
500


甘露二糖
500
500
500
800
1000


纤维素
500
500
400
400
300


糖原
2000
1800
1600
1500
1400


对比例4







核糖
200
500
1000
800
800


果糖
2000
1800
1600
1500
1400


异麦芽糖
1000
1000
1000
800
600


纤维二糖
200
300
400
300
200


支链淀粉
700
800
900
800
700


纤维素
500
500
400
400
300


对比例5







果糖
2000
1800
1600
1500
1400


木糖
1000
2000
3000
4000
3000


麦芽酮糖
100
400
600
500
500


纤维二糖
200
300
400
300
200


葡聚糖
1500
1800
2000
2000
2000


凝胶多糖
100
200
300
400
500






。


5.根据权利要求4所述的CHO细胞培养方法，所述的补料培养基中还包括脂类、氨基酸、维生素、无机盐等。


6.根据权利要求5所述的CHO细胞培养方法，所述的补料培养基中还包括组合培养基成分（单位mg/L）：













补料1
补料2
补料3
补料4
补料5


亚麻酸
0.04-0.12
0.04-0.12
0.04-0.12
0.04-0.12
0.04-0.12


亚油酸
0.08-0.27
0.08-0.27
0.08-0.27
0.08-0.27
0.08-0.27


胆固醇
1.5-7.5
1.5-7.5
1.5-7.5
1.5-7.5
1.5-7.5


花生四烯酸
0.001-0.007
0.001-0.007
0.001-0.007
0.001-0.007
0.001-0.007


孕酮
0.02-0.15
0.02-0.15
0.02-0.15
0.02-0.15
0.02-0.15


棕榈酸
0.15-0.30
0.15-0.30
0.15-0.30
0.15-0.30
0.15-0.30


胰岛素
0.01-0.05
0.01-0.05
0.01-0.05
0.01-0.05
0.01-0.05










甘氨酸
28-84
28-84
28-84
28-84
28-84


L-异亮氨酸
80-250
80-250
80-250
80-250
80-250


L-亮氨酸
85-270
85-270
85-270
85-270
85-270


L-组氨酸
45-13...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖志华，
申请(专利权)人：上海奥浦迈生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31