一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型制造技术

本发明专利技术提供了一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型。本发明专利技术基于无标记细胞整合药理学技术，利用α2A肾上腺素受体稳定表达的细胞系，建立了筛选α2A肾上腺素受体的激动剂和拮抗剂的方法。此方法还可以用于研究影响α2A肾上腺素受体下游通路的调节剂。本发明专利技术构建的α2A肾上腺素受体细胞筛选模型不需要荧光标记且检测过程无需额外添加指示剂，具有无标记、无伤害、高通量、高灵敏等特点。其用于从天然产物库、代谢产物库及组合化学库中寻找α2A肾上腺素受体的激动剂、拮抗剂和通路活性分子或者活性化合物，及α2A肾上腺素受体参与的镇痛、镇静、缺血性心脏病、脓毒性心脏病和调节血压的药物筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型
本专利技术涉及细胞筛选领域，具体涉及一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型。
技术介绍
肾上腺素能受体是介导儿茶酚胺作用的一类组织受体，为G-蛋白耦联型。G蛋白偶联受体（G-protein-coupledreceptor,GPCR）是细胞信号传导中最重要的一类膜受体。根据其对去甲肾上腺素的不同反应情况，分为肾上腺素能α受体和β受体。相对来说去甲肾上腺素对于α受体的作用较肾上腺素更为敏感，而肾上腺素对β受体的作用会更敏感。α受体分为α1受体和α2受体。α2受体是一类重要的GPCR受体，根据其末端氨基酸不同，分为α2A，α2B，α2C共3个亚型。α2A是一种重要的GPCR，研究证明其与很多疾病相关。杨志芳等人通过构建CHO-α2A细胞和基因敲除模型动物，证明α2A受体在镇痛、镇静和调节血压中发挥重要作用；王华东等人发现阻断盲肠结扎穿孔小鼠的α2A受体可明显改善小鼠生存和心功能，并且减少心脏细胞凋亡，证明α2A受体在脓毒性心脏病中发挥重要作用。但是目前缺少可以高通量检测α2A受体的高效模型。因此，构建选择性α2A受体筛选模型，以发现α2A受体的内源性配体、高活性激动剂、拮抗剂及通路调节剂，对发现高选择性α2A药物有潜在的价值。目前受体的高通量筛选方法主要有传统的放射配体结合技术、FLIPR、WesternBlotting等。这些方法都有一定的局限性，如FLIPR虽然可以高通量检测成分，但是其染料价格昂贵，且步骤繁杂；WesternBlotting通量低，步骤繁琐，周期长，实验结果不稳定，不易于定量等不足，影响筛选结果的可靠性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为了实现上述目的，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，提供一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型，以高通量筛选α2A受体激动剂、拮抗剂和通路调节剂，及α2A受体参与的镇痛、镇静、缺血性心脏病、脓毒性心脏病和调节血压的药物筛选应用。本专利技术的技术方案为：基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达α2A的细胞系HEK-293-α2A，借助于已知的激动剂和拮抗剂，建立α2A受体的细胞筛选模型。根据待测样品的DMR信号谱与已知激动剂和拮抗剂的DMR特征信号谱的相似性，判断待测样品的激动活性、拮抗活性或者下游通路的调节影响。所述的无标记细胞整合药理学技术是将细胞受药物刺激产生的动态质量重置(dynamicmassredistribution,DMR)经谐振波导光栅生物传感器记录为可视化谱线，从而反映药物作用靶点和通路。无标记细胞整合药理学技术主要通过激动、脱敏和拮抗三个实验来确认活性结果。一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型的建立过程为：1）在具有谐振波导光栅生物传感器功能的384微孔板中接种HEK-293-α2A细胞，接种的细胞密度为2.0~2.5×104个/孔，细胞培养液体积为40µL/孔，接种后细胞培养时间为18~24h。2）将无选择性肾上腺素受体激动剂肾上腺素以浓度为1.2~10000nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；3）将选择性α2A激动剂Guanfacine以浓度为1.2~10000nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；4）将选择性α2A拮抗剂BRL44408以浓度为0.2~25000nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；5）获得的所有DMR特征信号谱具有浓度-响应依赖关系且具有灵敏性、饱和性及特异性。进一步的，待测样品具有激动活性的筛选步骤如下：1）将肾上腺素或Guanfacine以浓度为1.2~10000nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；2）将待测样品以0.01nM~100µM加入到接种HEK-293-α2A细胞的微孔板中，检测其DMR信号谱；3）关联分析步骤1）和步骤2）中的DMR信号谱，若步骤2）的DMR信号谱与1）中的DMR特征谱没有相似性，则样品没有激动活性；若具有轮廓相似性，则进行下一步骤；4）将α2A受体拮抗剂BRL44408以浓度0.2~25000nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的微孔板中，预处理5~60min，加入与步骤2）中相同浓度的待测样品，检测其DMR信号，若此DMR信号强度低于步骤2）中的DMR信号强度，则判断此样品为α2A受体的激动剂。进一步的，待测样品具有拮抗活性的筛选步骤如下：1）将待测样品和肾上腺素或Guanfacine分别加入到接种HEK-293-α2A细胞的微孔板中，待测样品浓度为0.01nM~100µM，肾上腺素或Guanfacine浓度为1.2~10000nM，检测DMR信号谱；2）若步骤1）中待测样品不引起DMR信号谱，再向步骤1）中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤1）中相同浓度的肾上腺素或Guanfacine，检测DMR信号谱；若此DMR信号比步骤1）中肾上腺素或Guanfacine的信号弱，可判断待测样品是α2A受体的拮抗剂。进一步的，待测样品对α2A通路有调节活性的步骤如下：1）将待测样品和肾上腺素或Guanfacine分别加入到接种HEK-293-α2A细胞的微孔板中，待测样品浓度为0.01nM~100µM，肾上腺素或Guanfacine浓度为1.2~10000nM，检测DMR信号谱；2）再向步骤1）中加入了待测样品的细胞板中继续加入与步骤1）中相同浓度的肾上腺素或Guanfacine，检测DMR信号谱，检测时间为1~60min；若此DMR信号比步骤1）中肾上腺素或Guanfacine的信号在上升期、平台期和延滞期某一个阶段不同；3）将α2A受体拮抗剂BRL44408以浓度0.2~25000nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的微孔板中，预处理5~60min，加入与步骤1）中相同浓度的待测样品，检测其DMR信号，若此DMR信号谱与步骤1）中的样品的DMR信号谱一致，可判断待测样品是α2A受体下游信号通路的调节剂。其中，所述上升期为1~40min、平台期为40~50min和延滞期为50~60min。本专利技术中所使用的技术方法为无标记细胞整合药理学技术，是将细胞受药物刺激产生的动态质量重置(dynamicmassredistribution,DMR)经谐振波导光栅生物传感器记录为可视化谱线，从而反映药物作用靶点和通路，其具有无标记、无伤害、高通量、高灵敏度等特点。因此，采用无标记细胞整合药理学技术构建α2A无标记高通量筛选模型可大大提高α2A的激动剂、拮抗剂及通路调节剂的发现效率，对阐述α2A的药理学和生理学功能具有重大意义，同时为α2A受体参与镇痛、镇静、缺血性心脏病、脓毒性心脏病和调节血压的药物筛选提供指导。附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型，其特征在于：基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达α2A的细胞系HEK-293-α2A，借助于已知的激动剂和拮抗剂，建立α2A受体的细胞筛选模型；/n根据待测样品的DMR信号谱与已知激动剂和拮抗剂的DMR特征信号谱的相似性，判断待测样品的激动活性、拮抗活性或者下游通路的调节影响；/n建立过程为：/n1）在Epic® 384孔生物感应器微型板中接种HEK-293-α2A细胞，接种的细胞密度为2.0~ 2.5 × 10

【技术特征摘要】
1.一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型，其特征在于：基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达α2A的细胞系HEK-293-α2A，借助于已知的激动剂和拮抗剂，建立α2A受体的细胞筛选模型；
根据待测样品的DMR信号谱与已知激动剂和拮抗剂的DMR特征信号谱的相似性，判断待测样品的激动活性、拮抗活性或者下游通路的调节影响；
建立过程为：
1）在Epic®384孔生物感应器微型板中接种HEK-293-α2A细胞，接种的细胞密度为2.0~2.5×104个/孔，细胞培养液体积为40µL/孔，接种后细胞培养时间为18~24h；
2）将无选择性肾上腺素受体激动剂肾上腺素以浓度为1.2~10000nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；
3）将选择性α2A肾上腺素受体激动剂Guanfacine以浓度为1.2~10000nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；
4）将选择性α2A受体拮抗剂BRL44408以浓度为0.2~25000nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；
5）获得的所有DMR特征信号谱具有浓度-响应依赖关系。


2.根据权利要求1所述一种α2A肾上腺素受体的细胞筛选模型，其特征在于，待测样品具有激动活性的筛选步骤如下：
1）将肾上腺素或Guanfacine以浓度为1.2~10000nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的384微孔板中，检测其DMR特征信号谱；
2）将待测样品以0.01nM~100µM加入到接种HEK-293-α2A细胞的微孔板中，检测其DMR信号谱；
3）关联分析步骤1）和步骤2）中的DMR信号谱，若步骤2）的DMR信号谱与1）中的DMR特征谱没有相似性，则样品没有激动活性；若具有轮廓相似性，则进行下一步骤；
4）将α2A受体拮抗剂BRL44408以浓度0.2~25000nM加入到接种HEK-293-α2A细胞的微孔板中，预处理5~60min，加入与步骤2）中相同浓度的待测样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，张鹏宇，王纪霞，王志伟，侯滔，单彩龙，薛珍珍，
申请(专利权)人：泰州医药城国科化物生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32