一种人乳寡糖LNFPI对照品的制备方法技术

本发明专利技术公开一种人乳寡糖LNFP I对照品的制备方法，本发明专利技术的方法包括以下步骤：首先以人乳中性糖总样为原料；然后溶解所述的人乳中性糖总样，并使用亲水色谱填料，流动相为水和有机溶剂，使用梯度或等度方式进行洗脱，获得LNFP I粗品；再然后溶解LNFP I粗品，并使用多孔石墨碳材料为色谱柱固定相，流动相为碱水和有机溶剂，使用梯度或等度方式进行洗脱，获得LNFP I纯品；最后浓缩并冷冻干燥LNFP I纯品，即获得人乳寡糖LNFP I对照品，该方法具有选择性好，分离效率高，稳定性好，操作简便可控等特点，适用于放大制备。适用于放大制备。适用于放大制备。

【技术实现步骤摘要】
一种人乳寡糖LNFP I对照品的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种寡糖的制备方法，具体为一种人乳寡糖LNFP I对照品的制备方法。
技术背景
[0002]人乳寡糖是存在于人乳中的一类天然存在的低聚糖：对婴儿消化系统的早期发育，及出生后免疫系统的完善和体内生态平衡的建立发挥不可替代的。深入了解人乳寡糖生物和药理活性的前提是得到人乳寡糖样品，因此，以获得高纯度的人乳寡糖对照品为目标的寡糖制备技术就成为了寡糖研究中的关键步骤之一。然而，由于寡糖为极性的化合物，含有不同空间构型的单糖结构、不同的糖基序列、以及不同的糖置换方式，其可产生多样的结构种类，从而增加了分离的难度。
[0003]人乳寡糖LNFP I是中性糖中的一种，分子式为C
32
H
55
NO
25
，序列为：Fucα1
‑
2Galβ1
‑
3GlcNAcβ1
‑
3Galβ1
‑
4Glc，婴儿肠道菌群与人乳寡糖的特殊结构有着密不可分的关系，LNFP I可作为岩藻糖基化人乳寡糖的识别标志。许多研究发现，岩藻糖基化人乳寡糖中的成分可以被双歧杆菌有效分解利用，双歧杆菌既能调理肠道，又能改善维生素的代谢，增强肝脏的功能，它在肠道中通过代谢产生醋酸和乳酸降低肠道pH值，抑制腐生菌的生长，维护肠道微生态平衡，既能降低婴儿的受感染风险，又能够抵抗某些慢性疾病所带来的炎症。
[0004]近年来，对人乳寡糖制备的研究备受关注，目前对人乳寡糖分离纯化主要有3种策略：(1)、直接根据分子量的大小或所带电荷的不同，采用凝胶渗透色谱或高效阴离子交换色谱进行分离；(2)、对天然人乳寡糖进行衍生化修饰后，再利用反相或正相色谱进行分离；(3)、通过化学方法、酶促方法、化学
‑
酶促方法，合成母乳寡糖。由于人乳寡糖异构体较多，策略1的选择性较低，时间周期长，制备效率低。策略2虽然具有一定的选择性，但得到的寡糖为衍生物形式，破坏了天然母乳寡糖的原始结构。策略3化学方法面临糖基供体存在电子、空间的阻碍，使其较难形成糖苷键，同时在反应过程中还存在立体化学消旋产生的副产物等缺点，酶促反应中，糖基转移酶以及糖苷酶的来源以及活性底物受到一定的限制。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种人乳寡糖LNFP I对照品的制备方法，所述的方法包括以下步骤：
[0006]S1、以人乳中性糖总样为原料；
[0007]S2、所述的人乳中性糖总样与第一溶剂混合，溶解并得到第一混合物，并使用亲水色谱填料，流动相为水和有机溶剂，使用梯度或等度方式进行洗脱，利用柱色谱分离获得LNFP I粗品；
[0008]S3、所述的LNFP I粗品与第二溶剂混合，溶解并得到第二混合物，并利用多孔石墨碳材料为色谱柱固定相，流动相为碱水和有机溶剂，使用梯度或等度方式进行洗脱，利用柱色谱分离获得LNFP I纯品；
[0009]S4、浓缩并冷冻干燥LNFP I纯品，即获得人乳寡糖LNFP I对照品。
[0010]优选的，所述步骤S2中的第一溶剂为40
‑
60％甲醇溶液,所述步骤S3中的第二溶剂为水溶液。
[0011]优选的，所述步骤S2中的亲水色谱填料为硅胶表面键合半胱氨酸极性基团的填料，所述步骤S3中的碱水溶液为0.2％～0.6％的氢氧化铵水溶液。
[0012]优选的，所述步骤S2和S3的有机溶剂为乙醇、甲醇、乙腈中的一种或二种以上。
[0013]优选的，所述步骤S2中等度洗脱方式为：流动相中水溶液的体积比例为5％～95％；或使用线性梯度方式为：流动相中水溶液的体积浓度从小到大变化，起始体积浓度为5
‑
60％，终止体积浓度为40
‑
95％；或台阶梯度方式为：按流动相中水溶液的体积比例从5％～95％中从小至大随机选取2个以上进行洗脱操作。
[0014]优选的，所述步骤S3中等度洗脱方式为：流动相中有机溶剂的体积比例为5％～95％；或使用线性梯度方式为：流动相中有机溶剂的体积浓度从小到大变化，起始体积浓度为5
‑
60％，终止体积浓度为10
‑
95％；或台阶梯度方式为：按流动相中有机溶剂的体积比例从5％～95％中从小至大随机选取2个以上进行洗脱操作。
[0015]优选的，所述步骤S2和S3中色谱参数优化如下：
[0016]①
固体载样量为0.01％
‑
15％；
[0017]②
流速为0.1
‑
2倍柱体积/min；
[0018]③
色谱柱内径为4.6
‑
500mm。
[0019]优选的，所述的步骤S1中人乳中性糖总样由以下步骤的方法制备得到：
[0020]S1、取人乳样品在0～10℃条件下离心5～150min除去上层脂质，即得脱脂母乳样品，再加入1～5倍体积量的乙醇至脱脂母乳样品中，混匀，于0～10℃静置2～48小时后，于0～10℃条件下离心5～150min，收集上层液，蒸干后即得脱脂除蛋白的样品；
[0021]S2、利用硅胶表面键合天冬氨酸极性基团的填料柱色谱分离脱脂除蛋白的样品，采用体积浓度20～80％的乙醇水溶液溶解脱脂除蛋白的样品，流动相为2～12mM乙酸铵缓冲盐溶液和乙醇溶液，缓冲盐水溶液的体积浓度从小到大变化，起始体积浓度为5
‑
60％，终止体积浓度为40
‑
95％，收集在3
‑
40倍柱体积的流出液，将流出液浓缩冻干，即为步骤S1中所述的中性糖总样。
[0022]本专利技术具有如下优点：
[0023]1、溶剂消耗少，工艺过程中的溶剂可回收再利用；
[0024]2、制备条件简单，样品无需衍生化，保留了寡糖的原始结构；
[0025]3、重复性好，本专利技术中使用的色谱柱固定相具有很好的稳定性，易于放大制备。
附图说明
[0026]图1为本专利技术实施例1所得LNFP I对照品HPLC检测图谱；
[0027]图2为本专利技术实施例2所得LNFP I对照品HPLC检测图谱；
[0028]图3为本专利技术实施例3所得LNFP I对照品HPLC检测图谱；
[0029]图4为本专利技术对比例1所得LNFP I的HPLC检测图谱；
[0030]图5为本专利技术方法流程示意图。
具体实施方式
[0031]下面将结合本专利技术实施例中的附图1至5，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0032]根据图5所示的一种人乳寡糖LNFP I对照品的制备方法，所述的方法包括以下步骤：
[0033]S1、以人乳中性糖总样为原料；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人乳寡糖LNFP I对照品的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：S1、以人乳中性糖总样为原料；S2、所述的人乳中性糖总样与第一溶剂混合，溶解并得到第一混合物，并使用亲水色谱填料，流动相为水和有机溶剂，使用梯度或等度方式进行洗脱，利用柱色谱分离获得LNFP I粗品；S3、所述的LNFP I粗品与第二溶剂混合，溶解并得到第二混合物，并利用多孔石墨碳材料为色谱柱固定相，流动相为碱水和有机溶剂，使用梯度或等度方式进行洗脱，利用柱色谱分离获得LNFP I纯品；S4、浓缩并冷冻干燥LNFP I纯品，即获得人乳寡糖LNFP I对照品。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中的第一溶剂为40
‑
60%甲醇溶液，所述步骤S3中的第二溶剂为水溶液。3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中的亲水色谱填料为硅胶表面键合半胱氨酸极性基团的填料，所述步骤S3中的碱水溶液为0.2%~0.6%的氢氧化铵水溶液。4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2和S3的有机溶剂为乙醇、甲醇、乙腈中的一种或二种以上。5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中等度洗脱方式为：流动相中水溶液的体积比例为5%~95%；或使用线性梯度方式为：流动相中水溶液的体积浓度从小到大变化，起始体积浓度为5
‑
60%，终止体积浓度为40
‑
95%；或台阶梯度方式为：按流动相中水溶液的体积比例从5%~95%中从小至大随机选取2个以上进行洗脱操作。6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，王超然，郭志谋，闫竞宇，郭秀洁，吉素志，万瑛，董海临，李效农，薛兴亚，
申请(专利权)人：泰州医药城国科化物生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：