用于人干扰素-κ活性检测的细胞系及其构建和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于人干扰素‑κ活性检测的细胞系及其构建和检测方法。本发明专利技术的细胞系通过使用ISRE(干扰素敏感响应元件)荧光素酶报告基因转染真核细胞，通过稳定筛选单克隆细胞系获得。本发明专利技术构建的细胞系易于培养扩增和传代稳定性好，且检测人干扰素‑κ的活性具有灵敏度高、检测时间短、4‑6小时内即可完成、能够大幅提高人干扰素‑κ在生产过程制造中的活性放行效率的优点。

【技术实现步骤摘要】
用于人干扰素-κ活性检测的细胞系及其构建和检测方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及利用稳定转染的细胞系检测人干扰素-κ的活性。
技术介绍
干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的细胞因子。其可以通过结合靶细胞上的同源受体复合物而发挥抗病毒的活性。干扰素卡帕(interferon-κ，IFN-κ)是近年来发现的一个新的IFN成员，其中IFN-κ由207个氨基酸残基组成，包括N端27个氨基酸残基的信号肽，与Ⅰ型IFN的其他成员具有约30％的同源性，IFN-κ员比其他Ⅰ型IFN稍大，在C和D螺旋间有12个氨基酸残基的插入。IFN-κ基因位于第9对染色体短臂，与其他Ⅰ型IFN的基因邻近，且IFN-κ基因的3’端非编码区含有1个内含子。IFN-κ与IFN-α、IFN-β共同使用一个受体蛋白，属于I型干扰素。目前，已有研究发现编码IFN-κ基因选择性地在上皮角蛋白细胞中表达，重组的hIFN-κ与其他同型的干扰素类似，可以保护细胞免于病毒的感染；且表达具有种族的特异性。2019年新冠疫情爆发后，在缺少特效药物的情况下，干扰素-α作为广谱抗病毒药物被列入新冠治疗方案。然而，研究表明多种病毒对干扰素α已经产生耐药机制，如登革热、西尼罗河病毒、寨卡病毒等。干扰素-κ与干扰素α不同，氨基酸序列只有35％同源，因此许多耐受干扰素α的病毒对干扰素κ依然敏感。来自上海公共卫生临床中心的实验表明，干扰素-κ在2019新冠肺炎重症患者的治疗上能够缩短住院时间，更快速地缓解肺炎症状。因此，干扰素-κ(IFN-κ)有望成为治疗新冠肺炎的创新药物。然而hIFN-κ的生产制造技术难度高，产量低，其中在产品活性检测这一环节也颇为耗时。目前，干扰素产品活性检测多采用《中国药典》推荐的I型干扰素活性测定方法，但药典描述的两种方法都需要培养18-24小时的时间。目前，现有技术中对于hIFN-κ快速检测活性的方法研究较为罕见。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于干扰素、尤其是hIFN-κ活性检测的细胞系，通过该细胞系实现了对干扰素活性的快速且可靠的检测。本专利技术的另一目的在于提供一种干扰素活性检测的细胞系的构建方法，通过构建该稳定的单克隆细胞系，用于干扰素-κ活性放行，在较短的培养时间后实现灵敏可靠的活性检测结果。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种用于人干扰素-κ(hIFN-κ)活性检测的细胞系，所述细胞系转染ISRE(Interferon-sensitiveresponseelement，干扰素敏感响应元件)荧光素酶报告基因元件。在一个具体的实施例中，所述的细胞系为哺乳动物细胞系，优选为人来源的细胞系，最优选的为人胚胎肾细胞系HEK293；在另外的一个具体的实施例中，所述的ISRE荧光素酶报告基因元件是通过质粒转染细胞系，优选的所述质粒是真核生物细胞表达质粒，最优选为PCBRG-ISRE；在另外一个具体的实施例中，所述的细胞系是经过稳定筛选获得的单克隆细胞系；；在另外一个具体的实施例中，所述细胞系为保藏号CCTCCNO:C2020256的人胚肾细胞HEK293-ISRE-Luc-JY，所述的细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2020年12月8日。一种用于人干扰素-κ(hIFN-κ)活性检测的细胞系的构建方法，包括以下步骤：1)细胞复苏培养；2)转染报告基因质粒；3)筛选；4)混合克隆测试；5)有限稀释单克隆化；6)单克隆功能测试；7)单克隆传代稳定性测试。在一个具体的实施例中，所述报告基因质粒含有ISRE荧光素酶报告基因元件；优选地，所述质粒是真核生物细胞表达质粒；更优选地，所述质粒选自PCBRG-ISRE、pISRE-Luc和pGL3-ISRE中的任一种；进一步优选地，所述质粒为PCBRG-ISRE。在一个具体的实施例中，所述细胞系为哺乳动物细胞系，优选为人来源的细胞系，更优选地为人胚胎肾细胞系HEK293。在一个具体的实施例中，所述转染为脂质体转染，优选为Lipofectamin3000转染。在一个具体的实施例中，所述筛选为抗生素筛选，优选为潮霉素(hygromycin)抗性筛选。在一个具体的实施例中，所述细胞系是经过稳定筛选获得的单克隆细胞系。在一个具体的实施例中，对筛选后的细胞进行混合克隆的测试，其中，将梯度浓度稀释的hIFN-κ加入到混合克隆细胞悬液中，然后加入荧光素酶进行信号检测。在一个具体的实施例中，所述单克隆化是将混合克隆检测荧光信号良好的细胞进行扩大培养，然后进行传代，通过有限稀释法获得单克隆细胞系。在一个具体的实施例中，对获得的单克隆细胞系进行功能性和传代稳定性测试；优选地，将所获得的单克隆细胞系稀释到3x104-5x105个活细胞/ml，加入梯度浓度稀释的hIFN-κ，然后加入荧光素酶进行信号检测。在一个具体的实施例中，将信号检测良好的单克隆继续传代培养，分别在P5、P10、P15、P20代取部分细胞进行活性检测。在一个具体的实施例中，所述细胞复苏培养包括：将HEK293细胞从液氮罐中取出，于36-38℃水浴中融化复苏后在完全培养基中培养，放入37℃、5％二氧化碳细胞培养箱中，传代培养2-3代。在一个具体的实施例中，所述转染报告基因质粒包括：1)取传代培养后的HEK293细胞，胰酶消化，用完全培养基终止消化，吹打细胞，800-1500rpm离心5-10分钟，调整细胞浓度为3x104-5x105个细胞/ml；2)将细胞接种到6孔板中，每孔100-120μl，继续培养24-36小时；3)按照Lipofectamin(脂质体)3000转染试剂说明书，将2-4ugPCBRG-ISRE质粒转染至HEK293细胞，转染条件如下：(a)配制A管混合液：100-150μl减血清培养基(预热37℃)+2-5μgPCBRG-ISRE+5-8ulLipofectamin3000试剂，混匀；(b)配制B管混合液：100-150μl减血清培养基(预热37℃)+8-12μlLipofectamin3000转染试剂，混匀；(c)将A管混合液和B管混合液混合均匀得到转染液，室温放置3-10分钟；(d)取转染液加入HEK293细胞6孔板中，混匀；(e)将6孔板放入细胞培养箱中继续培养24-36小时。在一个具体的实施例中，减血清培养基是Opti-MEM。在一个具体的实施例中，所述筛选包括：细胞转染12-36小时后，在细胞中加入含有10％FBS和200ug/mlhygromycin的DMEM培养基，抗性筛选1-3周。在一个具体的实施例中，所述混合克隆测试包括：1)扩大培养后的HEK293-ISRE-Luc混合克隆细胞用胰酶消化，用筛选培养基终止消化，吹打细胞，800-1500rpm离心3-10分钟；2)弃上清，用筛选培养基吹打重悬细胞，得到细胞悬液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于人干扰素κ(hIFN-κ)活性检测的细胞系，其特征在于，所述细胞系转染ISRE(干扰素敏感响应元件)荧光素酶报告基因载体，所述细胞系为保藏号CCTCC NO:C2020256的细胞系，所述细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2020年12月8日。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于人干扰素κ(hIFN-κ)活性检测的细胞系，其特征在于，所述细胞系转染ISRE(干扰素敏感响应元件)荧光素酶报告基因载体，所述细胞系为保藏号CCTCCNO:C2020256的细胞系，所述细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2020年12月8日。


2.一种权利要求1所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)细胞复苏培养；2)转染报告基因质粒；3)筛选；4)混合克隆测试；5)有限稀释单克隆化；6)单克隆功能测试；7)单克隆传代稳定性测试。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述报告基因质粒含有ISRE荧光素酶报告基因元件；优选地，所述质粒是真核生物细胞表达质粒；更优选地，所述质粒选自PCBRG-ISRE、pISRE-Luc和pGL3-ISRE中的任一种；进一步优选地，所述质粒为PCBRG-ISRE。


4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述细胞系为哺乳动物细胞系，优选为人来源的细胞系，更优选地为人胚胎肾细胞系HEK293；所述转染为脂质体转染，优选为Lipofectamin3000转染；所述筛选为抗生素筛选，优选为潮霉素抗性筛选。


5.根据权利要求2-4中任一项所述的构建方法，其特征在于，将梯度浓度稀释的hIFN-κ加入到混合克隆细胞悬液中，然后加入荧光素酶进行信号检测。


6.根据权利要求2-4中任一项所述的构建方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭继先，柴辉，郭灵华，闫韵秋，钱文正，于海勤，
申请(专利权)人：山东晶辉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37