用于核酸治疗的可控偶联多肽纳米颗粒导入系统的组合物及方法技术方案

本发明专利技术提供特定种类的肽和多肽，所述肽或多肽用于制备纳米颗粒，将核酸和治疗药物导入到哺乳动物细胞、人体内以及其他哺乳动物内。本发明专利技术进一步提供制备肽、多肽和纳米颗粒的方法，以及使用纳米颗粒的方法。以及使用纳米颗粒的方法。以及使用纳米颗粒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于核酸治疗的可控偶联多肽纳米颗粒导入系统的组合物及方法
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]本申请旨在获得美国专利申请号为62/676,218的权益和优先权，该专利申请日期为2018年5月24日，其全文以引用方式并入本文中。
专利

[0003]本专利技术涉及特定的肽和多肽，这些肽和多肽用于制备将核酸和治疗药物输送到哺乳动物细胞、人体内、及其他哺乳动物的纳米颗粒。
[0004]专利技术背景
[0005]自从在哺乳动物中发现功能性RNAi途径以来，作为鉴定基因功能的一种方法，RNAi已经为反向遗传学提供了强大的工具，此外包括核苷酸类药物在内的潜在新型生物药物，如microRNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和DNA疫苗等药物所具备的RNAi潜力使其能够沉默任何基因，并使RNAi成为一种极具吸引力的治疗方式。近年来，siRNA药物因其特异性的序列转录体内后的基因沉默能力，已成为极具前景的新型治疗候选药物，可用于治疗诸如癌症、传染病、黄斑衰退症、心血管疾病、神经系统疾病和其它基因相关疾病。因其能够降低任何基因的表达，siRNA药物被誉为可治疗包括"不可成药"靶标在内的多种疾病的理想候选药物。
[0006]然而，限制RNAi药物进入临床应用的主要挑战是需要一个有效的转运载体(导入/递送系统)，这一转运载体必须能够有效保护和转运其所载物，并且到达靶标细胞外后，必须能够穿过细胞质膜，并且进入RNAi发挥作用的场所——细胞质。将siRNA递送到细胞质中的主要障碍包括：(a)活细胞对蛋白质和寡核苷酸等大分子的渗透性性很低；(b)细胞膜通常具有整体带负电荷的双层结构，因此带负电荷的siRNA很难渗透并跨过细胞膜进入胞内；(c)siRNA药物的稳定性较低，因此在很短的时间内会被体内高浓度血浆中存在的各种酶降解；(d)另一个重要的方面是，siRNA转运复合物在细胞内的内涵体逃逸，使siRNA药物从内涵体转移到细胞质，实现与其靶基因相应的mRNA结合；(e)siRNA可能被机体识别为异物，并诱发不良的免疫效应。理想的递送系统应能解决这些技术挑战中的大部分，以达到预期的治疗效果。
[0007]近年来，含有可电解的阳离子脂质的脂质纳米颗粒(LNP)，如1,2
‑
二林酰氧基
‑3‑
二甲基氨基丙烷(DLinDMA)已被用于将siRNA递送到肝脏。这类导入载体相关药物目前有20多项临床研究正在进行，以评估siRNA的临床应用。siRNA局部导入的例子包括：通过眼部途径治疗老年性黄斑衰退症[AMD](Quark制药，促血管新生因子，2期)；通过表皮给药治疗先天性骨质增生症[PC](TransDerm；角蛋白6a基因，1B期)；通过肺部途径治疗哮喘(ZaBeCor制药；酪氨酸蛋白激酶，2期)；通过鼻腔途径治疗呼吸道合胞病毒[RSV](Alnylam制药；RSV核衣壳蛋白，2期)；以及通过口服途径治疗家族性腺瘤性息肉病(Marina Biotech，β
‑
连环蛋白，I/2期)。siRNA的系统导入的例子包括：使用阳离子脂质纳米颗粒稳定核酸脂质颗粒(SNALP)
[1,2]治疗实体瘤(Tekmira制药；马球样激酶1[PLK1]，1期)和肝细胞癌(Alnylam制
药；血管内皮生长因子[VEGF]和激肽纺锤蛋白[KSP]，1期)
[3]。此外，Arrowhead Research(Calando制药)公司利用胆固醇结合的siRNA开发了一种用于乙肝病毒(HBV)感染的动态多聚缀合物递送系统(DPC)(I期临床试验)
[4]。在该递送系统中，siRNA与聚乙二醇(PEG)和N
‑
乙酰半乳糖胺的肝细胞靶向配体一起，通过可逆的二硫键联结到两性聚乙醚(PBAVE)上。与其他方法相比，纳米颗粒递送系统具有明显的优势。
[5]总体而言，在各种新兴的递送平台中，脂质纳米颗粒(LNP)已经成为系统性递送siRNA的最先进的递送平台之一。
[6][0008]最近，圣诺制药(盖瑟斯堡，马里兰州)开发了一种富含组氨酸
‑
赖氨酸的多肽导入系统，用于系统性递送双siRNA(转化生长因子
‑
β，TGF
‑
β1，和环氧酶
‑
2，COX
‑
2)，以达到协同作用，用于减少和预防增生性瘢痕(2期，临床试验)以及肝纤维化疾病或其他纤维化疾病的治疗
[7,8]。在该导入系统中，主要通过静电相互作用和氢键，使带正电荷的多肽和带负电荷的siRNA之间形成稳定的纳米颗粒。在目前的临床试验中表现出了良好的安全性和有效性，它是一类新型的导入系统，用于递送多序列特异性靶向siRNA，以达到双重治疗目的，用于治疗各种疾病。
[9][0009]本专利技术包括一种生物可降解多肽(称为“HKC2
‑
核酸递送系统”)，其中生物相容性多肽通过特定的非共价相互作用与核酸络合形成纳米颗粒。该多肽在生物相容的条件下，通过富含组氨酸
‑
赖氨酸多肽中的可生物解离的共价键自交联。这种整体设计和导入系统提高了核酸的体内稳定性和递送效率，可以作为在特定组织中获得沉默的有效手段。HKC2
‑
核酸递送系统是一种适用于各种疾病治疗的新型纳米颗粒转运载体，其机制是通过使核酸与单独的HKC2肽复合，或由多分支肽(HKP)组成的共递送制剂存在下发挥功能。这种多肽具有适当的正电荷，并具有可进一步修饰的官能团，以实现靶向特异性和降低毒性。
[0010]图示简介
[0011]图1.多肽纳米颗粒形成。(A)为具有特定肽序列的原位交联细胞穿膜肽(CPP)HKC肽，如K(HHHK)4C
‑
X
‑
C，或KHHHKHHKHHKHHKC
‑
X
‑
C；(B)为已经交联的多肽和选定的siRNA，及其在细胞内的递送，以及HKC多肽
‑
siRNA纳米颗粒暴露于细胞内的还原性GSH及其酶促产物作用下的细胞内释放机制。X是肽序列内的连接体，也可以是短的化学连接体。
[0012]图2A.a)HKP(H3K4b)和HKP(+H)支链肽的结构，b)H3K4C2(缩写为HKC2)末端伴有两个半胱氨酸位点的结构，c)HKC的一般结构。
[0013]图2B.HKC2的HPLC色谱图和积分表，该洗脱方法在C18反相柱上运行，峰保留时间为8.053，或在水(0.065％TFA)和乙腈(0.05％TFA)之间产生的梯度>91％。
[0014]图2C.HKC2的质谱(ESI
‑
MS，正)，展示了在1343[M]2+
处观察到的双电荷分子离子峰。
[0015]图3.图中显示了HKC多肽交联形成和降解的机制，主要通过使用氧气或DMSO氧化性成交联，在谷胱甘肽还原条件下发生降解。
[0016]图4.图中显示，通过暴露于多肽纳米颗粒PNP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分子式为Kp{[(H)n(K)m]}y
‑
C
‑
x
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Z或Kp{[(H)a(K)m(H)b(K)m(H)c(K)m(H)d(K)m]}y
‑
C
‑
x
‑
Z的肽，其中K是赖氨酸，H是组氨酸，C是半胱氨酸，x是连接子（连接器），Z是哺乳动物细胞靶向配体，p为0或1，n是范围为1
‑
5的整数，m是范围为0
‑
3的整数，a、b、c和d为3或4，y是从3
‑
10的整数。2.权利要求1所述的肽，其中n为3，m为0或1，y为4或8。3.权利要求1或2所述的肽，其中Z包括但不限于下列成分：肽，蛋白，抗体，小分子，碳水化合物的一部分，寡聚核苷酸。4.权利要求1或2所述的多肽，其中Z包含一种长度为1
‑
60个氨基酸的肽。5.权利要求4所述的肽，其中Z是一个氨基酸。6.权利要求5所述的肽，其中Z是C（半胱氨酸）。7.权利要求1
‑
6中任意一条所述的肽，其中x是单独一个氨基酸残基，或者一条2
‑
15个氨基酸构成的肽序列。8.权利要求7所述的肽，肽序列有3
‑
8个氨基酸。9.权利要求1
‑
8中任意一条所述的肽，肽可以被内在化进入哺乳动物细胞，优选的，哺乳动物细胞是人的细胞。10.权利要求1
‑
9中任意一条所述的肽，肽为线性结构。11.权利要求1
‑
9中任意一条所述的肽，肽为分支结构。12.一种包含至少2种权利要求1所述肽的多肽，通过可被切割的键相互交联。13.一种包含至少2种权利要求2
‑
11中任意一条所述肽的多肽，通过可被切割的键相互交联。14.权利要求12或13所述的多肽，所述可被切割的键是二硫键。15.权利要求12
‑
14中任意一条所述的多肽，多肽为线性结构。16.权利要求12
‑
14中任意一条所述的多肽，多肽为分支结构。17.一种包含权利要求12所述的多肽以及一种核酸的纳米颗粒。18.一种包含权利要求13
‑
16中任意一条所述的多肽以及一种核酸的纳米颗粒。19.权利要求17或18所述的纳米颗粒，进一步包含一种组氨酸
‑
赖氨酸共聚物。20.权利要求19所述的纳米颗粒，所述组氨酸
‑
赖氨酸共聚物是H3K4b或HKP(+H)。21.权利要求17
‑
20中任意一条所述的纳米颗粒，所述核酸包含一种siRNA。22.权利要求17
‑
21中任意一条所述的纳米颗粒，所述多肽和纳米颗粒在哺乳动物细胞内是可生物降解的。23.权利要求17
‑
22中任意一条所述的纳米颗粒，其直径是50
‑
300 nm。24.权利要求17
‑
22中任意一条所述的纳米颗粒，其直径是80
‑
130 nm。25.权利要求17
‑
24中任意一条所述的纳米颗粒，进一步包含一个功能基团，这一基团通过一个部分自由的硫醇基吸附到纳米颗粒表面。26.权利要求17
‑
24中任意一条所述的纳米颗粒，进一步包含一个功能基团，这一基团通过一个自由的硫醇基残基吸附到多肽序列内的半胱氨酸侧链。27.权利要求25或26所述的纳米颗粒，所述功能基团包括但不限于小分子、保护性聚乙二醇（PEG）、脂质、多肽或蛋白、寡聚核苷酸、含有可识别去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的糖结合位点的有机分子。
28.权利要求27所述的纳米颗粒，所述功能基团是保护性PEG分子。29.权利要求17
‑
28中任意一条所述的纳米颗粒，所述核酸包括但不限于siRNA、miRNA、反义寡聚核苷酸、质粒、mRNA、RNA酶、DNA酶和适配体序列。30.权利要求17
‑
29中任意一条所述的纳米颗粒，进一步包含第二种核酸分子。31.权利要求30所述的纳米颗粒，所述的第二种核酸包括但不限于siRNA、miRNA、反义寡聚核苷酸、质粒、mRNA、RNA酶、DNA酶和适配体序列。32.权利要求29或31所述的纳米颗粒，所述的siRNA分子为16
‑
27个碱基对长度的双链寡聚核苷酸分子。33.权利要求29或31所述的纳米颗粒，所述的siRNA分子为21
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25个碱基对长度的双链寡聚核苷酸分子，其末端为平末端或者为1
‑
3个核苷酸突出的粘性末端。34.权利要求17
‑
33中任意一条所述的纳米颗粒，进一步包含一种药物。35.权利要求34所述的纳米颗粒，所述药物包括但不限于小分子药物、多肽药物和蛋白药物。36.权利要求17
‑
35中任意一条所述的纳米颗粒，所述核酸包括表1
‑
3中已经鉴定的siRNA分子。37.权利要求17
‑
35中任意一...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕晓勇，陆阳，维拉，
申请(专利权)人：圣诺制药公司，
类型：发明
国别省市：