一种结构改造的抗菌肽BMAP-14及其应用制造技术

本发明专利技术属于蛋白质工程领域，具体涉及一种结构改造的抗菌肽BMAP

【技术实现步骤摘要】
一种结构改造的抗菌肽BMAP-14及其应用


[0001]本专利技术属于蛋白质工程领域，具体涉及一种结构改造的抗菌肽BMAP-14及其应用。

技术介绍

[0002]病原体对抗生素产生耐药性是全球公共卫生面临的严重威胁；解决办法之一是寻找新型的抗菌物质。抗菌肽具有分子量小、水溶性好、抗原性低、稳定性高等特点，尤其具有不易产生耐药性的特点。虽然其抗菌效果略低于传统的抗生素，但在耐药性病原体大量出现的今天,仍被认为是能取代现有抗生素的重要选择。目前，已有多种抗菌肽正在进行可行性研究。其中，Cathelicidin类抗菌肽广泛分布在人体内，及猴、鼠、兔、猪、鸡、鹌鹑、牛、羊、马、驴、鱼、蛇、蛙等多种动物体内。牛源cathelicidin类抗菌肽(含衍生肽)主要包括BMAP-18、BMAP-27、BMAP-28、BMAP-34、Bac4、Bac5、Bac7、Indolicidin和Dodecapeptide等。
[0003]目前已知的抗菌肽种类较多，虽然从理论上来说，抗菌肽分子越小，抗原性越小，生产和存储成本也越低，但多肽的改造存在很多不确定性，简单的增减、替换氨基酸，可能不会对多肽性能带来实质性影响，也可能使多肽几乎完全失去核心功能。
[0004]另外，影响抗菌肽在医药领域发挥作用的一个重要限制是溶血率。溶血率是指受到破坏、发生溶解的红细胞占正常红细胞的比例。天然抗菌肽往往容易导致红细胞发生溶血。例如，一篇名为《新型血红蛋白抗菌肽抑菌活性及溶血性研究》(动物医学进展，2014,35(9)：54-57)中公开了一种溶血率较低的抗菌肽，但在抗菌肽浓度为2mg/mL(2000μg/uL)时，溶血率也达到了6.7％，依然超过安全阈值。
[0005]因此，如果能提供一种新的改造后的抗菌肽，既保留抗菌肽优异的广谱抗菌活性，又具有极低的溶血率，将在医药领域发挥巨大作用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种结构改造后的抗菌肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]相应的，一种抗菌肽，将BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得，BMAP-18的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]相应的，所述抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。
[0010]相应的，所述抗菌肽的制备方法，将BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得。
[0011]相应的，所述抗菌肽的制备方法，按SEQ ID NO.1序列，化学合成或生物合成所述抗菌肽。
[0012]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种新的改造抗菌肽，保留了BMAP-18的N端结构，保留了广谱抗菌性能，具有良好的耐热性、一定的血浆稳定性，而且具有极低的溶血率，在高达8192μg/mL的浓度下，溶血率依然不足1％，可广泛应用于抗菌领域。
附图说明
[0013]图1为不同氨基酸长度的BMAP抗菌肽的空间结构示意图；
[0014]图2为各抗菌肽浓度与溶血率间关系示意图。
具体实施方式
[0015]本专利技术提供了一种结构改造后的抗菌肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述抗菌肽由牛源cathelicidin抗菌肽BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得，为单链多肽，全文命名为：BMAP-14。
[0016]本专利技术提供的抗菌肽具有抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌活性的作用；并具有极低的溶血性、良好的耐热性和一定的血浆稳定性，可广泛应用于制备抗菌相关产品。
[0017]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0018]实施例一：构建BMAP-14
[0019]1、使用I-TASSER预测，建立未经改造的抗菌肽BMAP-18的空间结构；设计BMAP-18的C端减少4个氨基酸的BMAP-14，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；同时设计BMAP-18的C端分别减少5个、3个、2个的多肽，分别命名为BMAP-13、BMAP-15、BMAP-16。经I-TASSER预测，设计的各多肽的空间结构如图1所示。图1中，由A至B，分别对应：BMAP-13、BMAP-14、BMAP-15、BMAP-16、BMAP-18。
[0020]从图1可以看出：本专利技术提供的BMAP-14与BMAP-18的N端最为接近，基本保持了BMAP-18的N端部分不变，暗示其可能保持了母体抗菌肽BMAP-18的抗菌活性；其余多肽的空间结构均在BMAP-18的N端基础上发生明显变化。
[0021]2、委托多肽合成公司化学合成抗菌肽BMAP-14和BMAP-18以进行后继实验。合成的各多肽纯度均大于95％，且经脱盐处理，为干粉状，置于-20℃保存，使用前用PBS配成所需浓度。
[0022]实施例二：BMAP-14性能检测
[0023]1、抗菌活性检测。
[0024](1)采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)的肉汤微量稀释法抗菌实验(M7-A8)，测定BMAP-14和BMAP-18对细菌的最小抑菌浓度(MIC值)，检测培养基为钙调MH肉汤培养基。
[0025](2)采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)的肉汤微量稀释法抗酵母样真菌药敏实验(M27-A2)，测定BMAP-14和BMAP-18对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC值)，检测培养基为沙氏葡萄糖液体培养基。
[0026](3)检测结果如表1所示。表1中，“ND”表示未检测到活性，“/”表示未进行对应试验。
[0027]表1各抗菌肽及对照抗生素的MIC值(μg/mL)
[0028][0029]从结果可以看出：BMAP-14对细菌的整体抗性略弱于BMAP-18，对真菌的抗性略强于BMAP-18。这两种抗菌肽对所检测的两株耐药菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌)均具有较好的抗性，其MIC值小于或等于对应的敏感菌(金黄色葡萄球菌ATCC29213和大肠埃希菌ATCC25922)，说明相比敏感菌，BMAP-14和BMAP-18对耐药菌的整体抗性更强。氨苄西林对两株耐药菌的MIC值已经超过本实验的检测上限(32μg/mL)，四环素对产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌的MIC值已经超过本实验的检测上限(64μg/mL)，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC值(64μg/mL)相对其敏感菌的MIC值(1μg/mL)提高了数十倍，说明作为对照的各抗生素对耐药菌株的整体抗性明显更弱。
[0030]2、溶血活性检测。
[0031]取健康成人新鲜血液(添加抗凝剂EDTA-K2)，900
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g离心15min，吸去血浆层。加入3倍的PBS，轻轻吹吸混本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种抗菌肽，其特征在于：将BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得，BMAP-18的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.权利要求1或2所述抗菌肽在制备抗菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘炯宇，江建平，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：