差向异构酶及其用途制造技术

本披露提供了可用于从果糖商业规模生产阿洛酮糖的差向异构酶。所披露的酶(“差向异构酶变体”)是多噬伯克霍尔德氏菌CGD1木糖异构酶的变体，所述变体经工程化以具有与亲本酶相比改善约1.5倍至2倍的催化活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】差向异构酶及其用途本申请要求于2018年8月8日提交的序列号62/716,204的优先权，将其通过引用以其全文并入本文。本披露中引用的各参考文献、专利和公开的专利申请均通过引用以其全文并入本文。本申请通过引用并入了创建于2019年8月5日且名为“00820000058sequencelisting”的178kb文本文件，该文本文件是本申请的序列表。
本披露总体上涉及阿洛酮糖的生产。附图说明图1.显示氨基酸取代对由野生型差向异构酶(204020，SEQIDNO:6)以及差向异构酶变体230338(SEQIDNO:16)、277285(SEQIDNO:90)、277286(SEQIDNO:92)、277287(SEQIDNO:94)、277288(SEQIDNO:96)、277289(SEQIDNO:98)和277290(SEQIDNO:100)转换的果糖的级分的影响的图。各对的左条，200mM；各对的右条，50％(w/w)。图2.显示野生型差向异构酶(204020，SEQIDNO:6)以及差向异构酶变体230338(SEQIDNO:16)、277285(SEQIDNO:90)、277286(SEQIDNO:92)、277287(SEQIDNO:94)、277288(SEQIDNO:96)、277289(SEQIDNO:98)和277290(SEQIDNO:100)的表达的图。图3.显示野生型差向异构酶(204020，SEQIDNO:6)以及差向异构酶变体230338(SEQIDNO:16)、277285(SEQIDNO:90)、277286(SEQIDNO:92)、277287(SEQIDNO:94)、277288(SEQIDNO:96)、277289(SEQIDNO:98)和277290(SEQIDNO:100)的比活性的图。各对的左条，200mM；各对的右条，50％DS。具体实施方式本披露提供了可用于从果糖商业规模生产阿洛酮糖的差向异构酶。所披露的酶(“差向异构酶变体”)是多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamultivorans)CGD1木糖异构酶(SEQIDNO:6)的变体，这些变体经工程化以具有与亲本酶相比改善约1.5倍至2倍的催化活性。下表1鉴别了所附序列表中各差向异构酶变体的氨基酸序列，并提供了编码该变体的核酸序列的实例。表2中总结了各差向异构酶变体和亲本酶(SEQIDNO:6)之间的氨基酸差异，其中氨基酸编号是指SEQIDNO:6的氨基酸编号。表1.差向异构酶变体的氨基酸序列以及编码序列的实例核酸、载体和宿主微生物本披露提供了编码上述披露的差向异构酶变体的核酸。序列表提供了编码这些变体的核苷酸序列的实例，但是编码差向异构酶变体的任何核苷酸序列均可使用。如本领域众所周知的，可以优化核苷酸序列以在多种微生物菌物种或菌株中表达。合适的微生物包括但不限于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、毕赤酵母属物种(Pichiasp.)、曲霉属物种(Aspergillussp.)、里氏木霉(Trichodermareesei)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。含有用于在这些生物中表达任何蛋白质的启动子和其他必要的调控序列的载体是已知的，并且是本领域普通技术人员容易获得的。编码上述差向异构酶变体的核酸可以包含在载体中，其中编码序列可操作地连接至合适的调控序列以在所需宿主微生物中表达。调控序列包含合适的mRNA核糖体结合位点和用于调节转录和翻译终止的序列，并且可以包括其他元件，诸如启动子或操纵子。一旦被转化到宿主微生物中，载体就可以独立于宿主基因组复制或起作用，或者可以整合至基因组自身中。使用的载体没有特别限制，并且可以是本领域已知的任何载体，只要它可以在宿主中复制即可。载体可以包含至少一种选择性标记物，诸如抗生素抗性基因。合适的抗生素包括例如阿米卡星、氨比西林、奥格孟汀(augmentin)(阿莫西林加克拉维酸)、头孢唑啉、头孢西丁、头孢他啶、头孢噻呋、先锋霉素(cephalothin)、氯霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、庆大霉素、亚胺培南、卡那霉素、青霉素、沙氟沙星(sarafloxicin)、壮观霉素、链霉素、四环素、替卡西林和替米考星。载体可用于工程化微生物以生产一种或多种上述差向异构酶变体。将载体递送至微生物的方法是众所周知的，并且包括例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、脂质介导的转染、电穿孔、缀合和感染。生产阿洛酮糖的方法可以使用本领域众所周知的方法，用本文披露的差向异构酶变体从果糖商业规模生产阿洛酮糖。参见，例如，US2017/0101637、US2017/0298400、US2016/0304853和US2016/0281076。在一些实施例中，将差向异构酶变体或来自包含该差向异构酶变体的微生物的提取物结合至固体基质，并使包含果糖的输入溶液在该基质上通过，以将至少一部分果糖转换为阿洛酮糖，可以从输出流中回收阿洛酮糖。任选地，可以将阿洛酮糖与输出流中的其他组分分离并且可以将其浓缩。适用于结合酶的许多固体基质是本领域众所周知的，并且包括藻酸盐(例如，海藻酸钠)、AMBERLITETM树脂(例如，(西格玛奥德里奇)、树脂或DUOLITETM树脂(例如，A568；陶氏化学(DowChemical))；以及PuroliteCR8415和ECR8314(漂莱特公司(Purolite))。另参见WO2016/160573和WO2016/191267。将差向异构酶固定在支持物上的方法是本领域技术人员众所周知的。参见，例如，美国专利8,375,106。在其他实施例中，表达差向异构酶变体的微生物可以被透化并固定在藻酸盐珠上，如美国专利8,735,106中所述，或固定在粘土、碳、硅藻土或水凝胶如聚丙烯酰胺上。本领域技术人员将理解，上述实施例的许多变化和置换都落在所附权利要求书的范围内。实例1.用于商业生产阿洛酮糖差向异构酶的无标记物枯草芽孢杆菌菌株的生成此实例描述了表达阿洛酮糖差向异构酶的无标记物枯草芽孢杆菌的生成。简而言之，在第一步中，用编码BMCGD1差向异构酶并包含抗生素抗性标记物的盒转化枯草芽孢杆菌菌株。该盒重组到芽孢杆菌染色体中，并敲除8kb的DNA，包括一个较大的孢子形成基因簇和赖氨酸生物合成基因lysA。在第二步中，将第二个盒重组到枯草芽孢杆菌染色体中，恢复lysA基因并去除编码抗生素抗性的DNA。在枯草芽孢杆菌转化之前，使用来自Keio保藏中心的大肠杆菌菌株39A10使质粒DNA传代。相关的表型是大肠杆菌的另一种野生型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码蛋白质的核酸，其中所述蛋白质的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:16、18、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98和100组成的组。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180808 US 62/716,2041.一种编码蛋白质的核酸，其中所述蛋白质的氨基酸序列选自由SEQIDNO:16、18、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98和100组成的组。


2.一种微生物，所述微生物包含如权利要求1所述的核酸。


3.如权利要求2所述的微生物，其中所述微生物选自由地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、恶臭假单胞菌、毕赤酵母属物种、曲霉属物种、里氏木霉、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌组成的组。


4.一种蛋白质，所述蛋白质包含选自由SEQIDNO:16、18、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84...

【专利技术属性】
技术研发人员：威廉·施罗德，帕德麦什·温基塔苏布拉马尼安，斯里达尔·戈文达拉扬，马克·韦尔奇，
申请(专利权)人：阿彻丹尼尔斯米德兰德公司，
类型：发明
国别省市：美国;US