寡核苷酸的检测方法或定量方法技术

本发明专利技术提供了用于寡核苷酸的检测方法和寡核苷酸的定量方法，与常规信号放大(PALSAR)测定方法相比，所述方法表现优异的特异性和定量性。在本发明专利技术中：将待测靶标寡核苷酸与互补核酸探针(3'‑靶标序列的互补序列‑5')杂交，或将具有添加到其上的给定碱基(聚(A)等)的待测靶标寡核苷酸与互补的核酸探针(3'‑靶标序列的互补序列+给定碱基的互补序列‑5')杂交，通过使用单链特异性核酸酶分解并去除不完全的杂交产物，并通过PALSAR方法测定剩余的完全杂交产物中包含的核酸探针。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】寡核苷酸的检测方法或定量方法
本专利技术关于具有高灵敏度以及优异的特异性和定量性的寡核苷酸的检测方法和定量方法。
技术介绍
核酸药物引起序列特异性基因沉默，因此其作为诸如遗传性疾病和顽固性疾病等难以治疗的各种疾病的新型治疗剂，近年来引起了极大的关注(非专利文献1，Ando2012)。在药物开发的探索阶段的药代动力学/药效学(PK/PD)筛查测试中，在非临床阶段的安全性、药理学和药代动力学测试中，以及在临床阶段，在接受药物施用的动物或人类生物样品中测定药物浓度。为了获得新药的批准，有必要获取生物样品中药物浓度的数据，并按照厚生劳动省条例所确立的准则提交与安全性和药代动力学有关的材料。Ando等人报道，通过用发射正电子的核素标记核酸药物，可以无创地，实时地对生物体内的行为进行三维分析(非专利文献1，Ando2012)。Healey等人报道，通过使用茎环RT-PCR方法(非专利文献3，Chen2005)，可以实现0.01pg/μL的定量下限(非专利文献2，Healey2014)。但是，近年来，人工核酸和递送材料的发展使得能够以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.样品中靶标寡核苷酸的检测方法，包括以下步骤：/n(i)使用于捕获靶标寡核苷酸的捕获探针与样品接触，/n所述捕获探针包含：/n(A)核酸探针，和/n(B)与所述核酸探针的3'端或5'端的核苷酸邻接的固相或衔接子或接头，/n所述核酸探针包含与靶标寡核苷酸的全部或部分序列互补的序列；/n(ii)使单链特异性核酸酶与经历了与所述捕获探针的接触步骤的样品接触；/n(iii)在进行了与所述单链特异性核酸酶的接触步骤之后，将所述样品中的捕获探针形成单链；/n(iv)使由第一寡核苷酸和第二寡核苷酸构成的能够自聚集的一对探针与经历了将捕获探针形成单链的步骤的样品接触，以形成捕获探针和寡核苷酸聚合物的复合物，...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180911 JP 2018-1693401.样品中靶标寡核苷酸的检测方法，包括以下步骤：
(i)使用于捕获靶标寡核苷酸的捕获探针与样品接触，
所述捕获探针包含：
(A)核酸探针，和
(B)与所述核酸探针的3'端或5'端的核苷酸邻接的固相或衔接子或接头，
所述核酸探针包含与靶标寡核苷酸的全部或部分序列互补的序列；
(ii)使单链特异性核酸酶与经历了与所述捕获探针的接触步骤的样品接触；
(iii)在进行了与所述单链特异性核酸酶的接触步骤之后，将所述样品中的捕获探针形成单链；
(iv)使由第一寡核苷酸和第二寡核苷酸构成的能够自聚集的一对探针与经历了将捕获探针形成单链的步骤的样品接触，以形成捕获探针和寡核苷酸聚合物的复合物，所述寡核苷酸聚合物由所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的自聚集产生；和
(v)检测所述复合物。


2.根据权利要求1所述的靶标寡核苷酸的检测方法，其中由所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸构成的能够自聚集的探针对中的至少一种寡核苷酸包含靶标寡核苷酸的全部或部分序列。


3.根据权利要求1所述的靶标寡核苷酸的检测方法，其中(iv)的复合物形成步骤包括
与辅助探针接触的步骤，所述辅助探针含有靶标寡核苷酸的全部或部分序列，以及与所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸中的至少一种的全部或部分序列互补的序列。


4.样品中靶标寡核苷酸的检测方法，包括以下步骤：
(i)向样品中的靶标寡核苷酸添加第一多核苷酸；
(ii)使用于捕获所述靶标寡核苷酸的捕获探针与所述靶标寡核苷酸接触，
所述捕获探针包含
(A)核酸探针，
(B)与所述核酸探针的3'端或5'端的核苷酸邻接的固相或衔接子或接头，
所述核酸探针包含与所述靶标寡核苷酸的全部或部分序列和/或所述第一多核苷酸的全部或部分序列互补的序列；
(iii)使单链特异性核酸酶与经历了添加第一多核苷酸的步骤以及与捕获探针的接触步骤的样品接触；
(iv)在进行了与单链特异性核酸酶的接触步骤之后，将所述样品中的捕获探针形成单链；
(v)使由第一寡核苷酸和第二寡核苷酸构成的能够自聚集的一对探针与经历了将捕获探针形成单链的步骤的所述样品接触，以形成捕获探针和寡核苷酸聚合物的复合物，所述寡核苷酸聚合物由所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的自聚集产生；和
(vi)检测所述复合物。


5.根据权利要求4所述的靶标寡核苷酸的检测方法，其中
向所述样品中的所述靶标寡核苷酸添加所述第一多核苷酸的步骤(i)为在与捕获探针的接触步骤之前将所述第一多核苷酸添加到所述样品中的所述靶标寡核苷酸的步骤。


6.根据权利要求4所述的靶标寡核苷酸的检测方法，其中
向所述样品中的所述靶标寡核苷酸添加所述第一多核苷酸的步骤(i)为在与捕获探针的接触步骤之后将所述第一多核苷酸添加到所述样品中的所述靶标寡核苷酸的步骤。


7.根据权利要求4至6中任一项所述的靶标寡核苷酸的检测方法，其中
由所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸构成的能够自聚集的探针对中的至少一种寡核苷酸包含所述第一多核苷酸的全部或部分序列。


8.根据权利要求4至6中任一项所述的靶标寡核苷酸的检测方法，其中
形成复合物的步骤(v)包括与辅助探针接触的步骤，其中
所述辅助探针包含所述靶标寡核苷酸的全部或部分序列和/或所述第一多核苷酸的全部或部分序列，以及与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸之一的全部或部分序列互补的序列。


9.根据权利要求4至8中任一项所述的靶标寡核苷酸的检测方法，其中所述第一多核苷酸具有聚(A)序列、聚(T)序列、聚(U)序列、聚(T/U)序列、聚(G)序列或聚(C)序列。


10.根据权利要求9所述的靶标寡核苷酸的检测方法，其中所述第一多核苷酸具有聚(A)序列。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的靶标寡核苷酸的检测方法，其中所述第一寡核苷酸是从5'端侧起依次至少包含核酸区域X、核酸区域Y以及核酸区域Z的寡核苷酸，而第二寡核苷酸是从5'端侧起依次至少包含与核酸区域X互补的核酸区域X'，与核酸区域Y互补的核酸区域Y'以及与核酸区域Z互补的核酸区域Z'的寡核苷酸。


12.根据权利要求11所述的靶标寡核苷酸的检测方法，其中所述核酸区域Z包含聚(A)序列，并且其中所述核酸区域Z'包含聚(T)序列。


13.根据权利要求1至12中任一项所述的靶标寡核苷酸的检测方法，其中所述单链特异性核酸酶为核酸内切酶。


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【专利技术属性】
技术研发人员：大森茜，涩泽幸一，
申请(专利权)人：积水医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP