基因组编辑方法、组合物、细胞、细胞制剂、以及细胞制剂的制造方法技术

一种离体细胞中的基因组编辑方法，其特征在于，通过对外源DNA的5’末端和3’末端中的至少一个末端进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入目标基因组。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因组编辑方法、组合物、细胞、细胞制剂、以及细胞制剂的制造方法
本专利技术涉及一种基因组编辑方法、组合物、细胞、细胞制剂以及细胞制剂的制造方法。本申请要求基于2018年3月29日在日本申请的特愿2018-66174号要求优先权，其内容援引入本文。
技术介绍
在想要向真核细胞的基因组的特定位点插入特定基因而将目标基因组DNA完全替换为期望的碱基序列的情况下，一般利用同源重组。具体地，实施在想要插入的外源DNA的两端(5’末端以及3’末端)使用具备具有与基因组上的进行插入的位点同源的序列的DNA(以下，称为同源臂。)的基因导入用载体(以下，称为靶向载体。)的操作。如果将涉及的载体导入靶细胞，则在基因组DNA与载体之间会发生同源重组，能够替换目标基因组DNA的期望的碱基序列。该替换的特点是无错误。但是，在来源于哺乳类的细胞中，由于这种同源重组发生的频率极低，为百万分之一，因此，同源重组的实用化，特别是在医疗应用方面的实用化是非常困难的。近年来，基因组编辑核酸酶的发现使得在基因组上的任意位置处切割DNA双链成为可能。其结果为，在基因组DNA与导入外源基因之间诱导同源重组变得容易(例如，参照专利文献1、非专利文献1至2)。在专利文献1中，公开了一种利用Cas9蛋白切割1细胞期胚胎的细胞的基因组，使用具备分别与目标序列的5’末端以及3’末端杂交的同源臂和与该同源臂相邻的核酸插入物(导入外源基因)的靶向载体，将所述核酸插入物导入所述细胞中的方法。在非专利文献1中公开了针对来源于β-地中海贫血患者的造血干细胞，利用组合了Cas9蛋白和腺病毒相关载体的CRISPR/Cas9系统，通过同源重组导入正常HBB(haemoglobinbeta：血红蛋白β)基因。但是，在近年来的技术中，非同源重组的发生频率比同源重组的发生频率高，同源重组的发生频率即使在最高的情况下也只有十分之一左右。因此，为了实现同源重组的实用化，需要进一步提高同源重组频率。作为提高同源重组的频率的尝试，例如有人提出了非专利文献3至4中举出的方法。在非专利文献2中，探索了在通过使用了CRISPR/Cas9系统的同源重组而进行的基因导入中，抑制非同源末端结合或者促进同源重组的低分子量化合物。公开了使用Scr7、L755507以及白藜芦醇作为这种低分子量化合物，促进了猪胎儿成纤维细胞中的同源重组。非专利文献3中公开了一种通过RNA干扰抑制KU70、DNA连接酶IV等的表达而降低非同源重组的频率，从而相对地提高同源重组的频率的方法。在非专利文献4中公开了一种通过在使用了CRISPR/Cas9系统的基因组编辑中，针对在Cas9从双链DNA解离之前非对称地释放的、与sgRNA不互补的切割DNA的3’末端提供互补的单链DNA，从而提高同源重组的频率的方法。在先技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2016/081923号。非专利文献非专利文献1：Nature.2016Nov17；539(7629)：384-389.CRISPR/Cas9β-globingenetargetinginhumanhaematopoieticstemcells.DeverD.etal.非专利文献2：SciRep.2017；7：8943.SmallmoleculesenhanceCRISPR/Cas9-mediatedhomology-directedgenomeeditinginprimarycellsGuolingLi,etal.非专利文献3：NatBiotechnol.2015May；33(5)：543-548.Increasingtheefficiencyofhomology-directedrepairforCRISPR-Cas9-inducedprecisegeneeditinginmammaliancells.ChuVT.,etal.非专利文献4：NatBiotechnol.2016；34：339-344,Enhancinghomology-directedgenomeeditingbycatalyticallyactiveandinactiveCRISPR-Cas9usingasymmetricdonorDNA.RicherdsonC,etal.
技术实现思路
专利技术要解决的问题然而，即使利用非专利文献3至4中的方法，同源重组的频率仍然较低，还存在改善的余地。关于针对DNA双链切割的DNA修复机制，已知非同源末端结合和同源重组。非同源末端结合比同源重组以更短时间进行。因此，为了提高同源重组的频率，需要想办法相对地降低非同源末端结合的发生频率。但是，如果抑制非同源末端结合的结构本身，则会大大地损害针对DNA的双链切割的细胞的修复能力，因而，对生物体的危害(无法生存、肿瘤化)变得过大。其结果为，在该方向性上的实用化以及临床应用很困难。本专利技术的目的在于提供一种能够在不损害细胞本来具有的非同源末端结合的能力的情况下提升同源重组的频率的基因组编辑方法、组合物、细胞、细胞制剂以及细胞制剂的制造方法。用于解决课题的技术手段专利技术人们发现如果在外源DNA的5’末端和3’末端将通常不用于同源重组的较短的同源臂用于靶向载体，则在切割目标基因组DNA的双链时，相对于非同源重组的同源重组的频率显著更高，从而完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述。(1)一种离体细胞中的基因组编辑方法，其特征在于，通过在切割目标基因组DNA的双链时，对外源DNA的5’末端和3’末端中的至少一个末端进行同源重组，从而将在5’末端和3’末端具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入目标基因组。(2)根据(1)所述的基因组编辑方法，其中，通过对所述外源DNA的5’末端和3’末端中的两个末端都进行同源重组，从而将外源DNA导入所述目标基因组。(3)根据(1)或(2)所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为血细胞或未分化细胞。(4)根据(1)至(3)中任一项所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为干细胞。(5)根据(1)至(4)中任一项所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为造血干细胞。(6)根据(1)所述的基因组编辑方法，其中，通过对所述外源DNA的5’末端和3’末端中的一个末端进行同源重组，对另一个末端进行非同源重组，从而将外源DNA导入所述目标基因组。(7)一种离体细胞中的基因组编辑方法，其特征在于，通过对外源DNA的5’末端和3’末端中的两个末端都进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入目标基因组。(8)根据(7)所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为血细胞或未分化细胞。(9)根据(7)或(8)所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为干细胞。(10)根据(7)至(9)中任一项所述的基因组编辑方法，其中，所述细胞为造血干细胞。(11)一种组合物，其特征在于，含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因组编辑方法，其是离体细胞中的基因组编辑方法，其特征在于，/n通过在切割目标基因组DNA的双链时，对外源DNA的5’末端和3’末端中的至少一个末端进行同源重组，从而将在5’末端和3’末端具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入目标基因组。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180329 JP 2018-0661741.一种基因组编辑方法，其是离体细胞中的基因组编辑方法，其特征在于，
通过在切割目标基因组DNA的双链时，对外源DNA的5’末端和3’末端中的至少一个末端进行同源重组，从而将在5’末端和3’末端具有小于500bp的长度的同源臂的外源DNA导入目标基因组。


2.根据权利要求1所述的基因组编辑方法，其中，
通过对所述外源DNA的5’末端和3’末端中的两个末端都进行同源重组，从而将外源DNA导入所述目标基因组。


3.根据权利要求1或2所述的基因组编辑方法，其中，
所述细胞为血细胞或未分化细胞。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因组编辑方法，其中，
所述细胞为干细胞。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因组编辑方法，其中，
所述细胞为造血干细胞。


6.根据权利要求1所述的基因组编辑方法，其中，
通过对所述外源DNA的5’末端和3’末端中的一个末端进行同源重组，对另一个末端进行非同源重组，从而将外源DNA导入所述目标基因组。


7.一种基因组编辑方法，其是离体细胞中的基因组编辑方法，其特征在于，
通过对外源DNA的5’末端和3’末端中的两个末端都进行同源重组，从而将具有小于500bp的长度的同源臂的外源双链DNA导入目标基因组。


8.根据权利要求7所述的基因组编辑方法，其中，
所述细胞为血细胞或未分化细胞。


9.根据权利要求7或8所述的基因组编辑方法，其中，
所述细胞为干细胞。


10.根据权利要求7至9中任一项所述的基因组编辑方法，其中，
所述细胞为造血干细胞。


11.一种组合物，其特征在于，
含有外源双链DNA，所述外源双链DNA在其两端具有小于500bp的长度的同源臂。


12.根据权利要求11所述的组合物，其中，
还含有目标基因组DNA切割酶或编码所述酶的DNA或mRNA。


13.根据权利要求11或12所述的组合物，其中，
所述组合物是药用的。


14.根据权利要求11至13中任一项所述的组合物，其中，
所述组...

【专利技术属性】
技术研发人员：花园丰，原弘真，鱼崎英毅，
申请(专利权)人：学校法人自治医科大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP